细胞的癌变是一个多因素、多步骤、多基因参与调控，多阶段、多步骤演化的复杂过程。癌基因的激活及抑癌基因的失活是肺癌发生、发展中最常见的基因异常。某些基因结构和功能表达异常的检测不仅对诊断、预后评估、疗效检测有重要的临床意义，而且可为高危人群提供可能的早期诊断和筛选手段，使这些基因成为重要的肺癌分子标记物。
一、癌基因
(一)K-ras基因
ras基因家族是由H-ras、N-ras及K-ras组成，相对分子质量为21 kDa称为p21，为细胞内膜蛋白。在肺癌中，ras基因突变主要在NSCLC，其中大多数为肺腺癌，而在SCLC中少见。已发现20%～30%的腺癌和15%～20%的NSCLC中有ras基因突变。K-ras是ras家族中最常见的基因突变，在肺腺癌中K-ras基因突变占ras基因突变的90%～100%，其中85%的K-ras基因突变累及第12位密码子。具有特征性的是70%的K-ras突变为G→T颠换，导致正常的甘氨酸(GGT)被半胱氨酸(TGT)或颉氨酸(GTT)替换。这种高发于肺腺癌中的K-ras基因突变的G→T颠换，不同于其他肿瘤如结肠癌中常见的G→A转换，这种差异可能反应了不同肿瘤之间致癌机制的差异。
大量DNA的加合物是造成基因损伤的常见类型，这表明K-ras 12位点可能是烟草诱变激活的特异性分子靶点。许多研究表明，ras突变与吸烟有关，近期吸烟和曾有吸烟史的肺腺癌患者Kras的点突变率分别为32%和30%，明显高于未吸烟的肺癌患者(7%)，但K-ras基因突变的频率与戒烟史的长短无关。这些结果提示，ras基因突变是肺腺癌发生的早期事件，而且是不可逆的过程。K-ras突变还是NSCLC各期的一个重要的负性预后因素。已有临床资料表明，K-ras基因突变的肺腺癌患者预后不良。周清华等报道，K-ras基因突变的25例NSCLC术后生存率为24%，而无K-ras基因突变的35例为40.4%。
肺癌K-ras基因突变常发生在临床症状出现之前，因此可用于早期诊断。多项研究均报道，在原发性肺癌患者痰液中发现K-ras基因突变。美国Johns Hopkins肺癌研究中心建立了一种适宜于人群普查的方法，即对常规细胞学检查阴性的肺癌患者再检测其痰液脱落细胞中K-ras基因状态。结果发现10例中的8例有K-ras及p53突变，随访提示阳性的8例后来均发生腺癌，采用痰液脱落细胞的K-ras基因突变分析可比Ⅰ临床诊断肺癌提前1年，因而认为该检测方法也许可作为肺癌的临床前期或早期诊断的有效方法。1999年，Adrendt报道，用K-ras突变Ligation实验技术分析肺癌患者支气管肺泡灌洗液(BALF)中K-ras的突变率，在腺癌虽然检出率为组织中的50%，这种K-ras突变的筛选对肺腺癌的早期诊断仍有意义。因为在Johns Hopking肺癌总体研究中，常规的癌细胞学检查所发现的肺癌均为鳞癌细胞，而这种分子生物学方法检测的K-ras突变敏感性较高，在所有肺腺癌患者的BALF中即使只有不到l%的癌细胞也能被发现。因此，较常规细胞学涂片，该方法更利于腺癌的发现。综上所述，这些研究表明，K-ras基因突变是肺癌的一种有意义的肺癌基因标记物，特别在肺腺癌中有较高的阳性率。从肺癌患者痰液标本或BALF中检测出K-ras突变这一事实，可认为这些方法在肺癌的诊断中可作为细胞学的一种重要辅助手段。这些方法的临床应用对某些肺癌患者无疑具有早期诊断价值，并能避免应用某些创伤性诊断技术。这些方法的限制在于非特异性扩增、假阳性突变和仅30%左右的肺腺癌患者有活化的K-ras基因。
(二)myc基因
myc家族包括c-myc、N-myc和L-myc几种类型，属核内癌基因。c-myc基因的活化包括基因过度表达、扩增及易位，均与人肺癌发生发展有关。c-myc蛋白能推进细胞周期，促使细胞转化及抑制细胞分化。但c-myc通过基因扩增等方式被激活后，则细胞过度增殖，并导致细胞恶性转化，与肿瘤的发生及癌性增生密切相关。c-myc常在SCLC及NSCLC活化，而N-myc及L-myc的异常往往仅在SCLC中发现。在NSCLC患者中，8%～10%存在c-myc的扩增。在SCLC中myc基因主要通过基因扩增而活化，18%的肿瘤和31%的细胞系有c-myc的扩增。研究表明，c-myc基因扩增仅见于“变异型SCLC”，此型细胞系表现为增殖快，对化疗和放疗更具抗性。而不具备上述特征的“经典型SCLC”则缺乏c-myc过度表达。c-myc基因扩增与肺癌患者生存期呈负相关，在化疗后复发的肿瘤中比未经治疗患者的肿瘤敏感。原位杂交显示，50%以上的NSCLC存在myc基因过度表达，后者与增生性癌前病变的程度呈正相关。c-myc是一种原癌基因，在调节DNA合成、细胞凋亡、分化及细胞周期的进行中起重要作用，该基因是决定细胞从G0/G1期进入S期的驱动因子。
(三)c-erbB基因
c-erbB基因属于生长因子受体类癌基因，包括c-erbB-2(HER2/neu)及c-erbB-1，并具有酪氨酸激酶活性，在细胞的信号传递中起重要作用。c-erbB基因扩增涉及肺癌的发生发展过程。c-erbB-1编码具有酪氨酸激酶活性的EGFR，由c-erbB-l编码的EGFR在NSCLC(特别是鳞癌)中较在SCLC中更常发生过度表达。90%的鳞癌和75%的腺癌中有c-erbB-1蛋白过度表达，20%肺鳞癌可见该基因的扩增。c-erbB-1的过度表达常被认为是该基因的激活，而非通过突变，其过度表达可能与肺癌的分期、分化及预后有关。Fujino等报告检测41例Ⅰ期NSCLC中EGFR高表达与患者生存有关。EGFR阳性者5年生存率为66.7%，EGFR阴性者为83.3%。c-erbB-2基因产物p185neu与EGFR同源，在肺癌中，c-eabB-2基因扩增并不多见，但30%～60%的NSCLC存在c-erbB-2基因的过度表达，尤其在肺腺癌更为明显，但在SCLC中则未发现有c-erbB-2基因的扩增和过度表达。c-erbB-2的过度表达与NSCLC特别是肺腺癌患者预后密切相关，伴有c-erbB-2过度表达的肺癌，患者存活期短，并易发生浸润和产生耐药，可以作为NSCLC细胞中的一种内源性多药耐药性的标志。
(四)原癌基因Bcl-2
Bcl-2蛋白是原癌基因Bcl-2编码的一种能调节细胞死亡而不影响细胞增殖的蛋白质。1993年Pezzella等研究，Bcl-2在NSCLC患者中的表达与预后之间的关系。该实验采用Bcl-2特异性单克隆抗体及免疫组化染色测定80例肺鳞癌及42例肺腺癌患者肿瘤组织中Bcl-2蛋白。结果25%(20/80)的鳞癌患者及12%(5/42)的腺癌患者Bcl-2蛋白阳性，在邻近的正常呼吸道上皮中，Bcl-2蛋白仅存在于基底细胞。Bcl-2蛋白阳性患者的5年生存率高于阴性患者(P＜0.01)，年龄≥60岁、Bcl-2蛋白阳性患者的预后最好(P＜0.02)。该研究表明，原癌基因Bcl-2在肺癌患者中发生异常表达，其表达与预后有一定关系。
二、抑癌基因
(一)p53基因
p53基因定位于染色体17p13.1，编码一种53 kD的核蛋白，长约20 kd，含有11个外显子，10个内含子，有野生型和突变型之分。野生型p53蛋白是细胞生长的监视器。p53基因通过对细胞生长的调控和诱导衰老、变异的细胞进入程序性死亡而抑制肿瘤的形成。但p53基因也是人类肿瘤最常见的突变或缺失基因。突变的p53不但丧失了正常p53基因的功能，而且自身获得了癌基因的功能，使得衰老细胞、异常细胞不能按正常程序死亡或清除而在体内不断地增殖，导致肿瘤的发生。野生型p53基因半衰期短不易检测，免疫组化检测到的为突变型p53基因，且p53突变和p53蛋白在组织中的表达是一致的。本实验结果提示，NSCLC组织细胞中p53的阳性表达率明显高于正常肺组织，提示p53与NSCLC的发生有关。
p53蛋白与肺鳞癌的关系可能较肺腺癌更为密切。而且在肺鳞癌伴有和不伴有淋巴结转移病例中，p53表达无显著性差异，而肺腺癌中伴有与不伴有淋巴结转移者p53表达具有显著性差异，提示p53过度表达与肺腺癌淋巴结转移有关。
(二)p16基因
p16基因蛋白是迄今为止发现的第1个直接控制细胞增殖周期的细胞固有蛋白，直接作用于CDK4、Cyclin D1和Rb的反馈回路，通过调节Rb基因蛋白的活性，防止细胞过度增殖。p16蛋白抑制细胞增殖使细胞停滞于G1期的机制是，与Cyclin D1竞争结合CDK4，使CDK4失活，从而阻止Rb的磷酸化，去磷酸化的Rb以活性形式结合E2F及ATF2等转录因子，发挥其负调控细胞生长的作用。鳞癌、腺癌等NSCLC的p16丢失明显，丢失率达57.9%，p16蛋白的表达与癌细胞的分化无关。但与淋巴结转移密切相关，随转移的发生和病程的进展，p16丢失率明显上升。p16基因的丢失广泛存在于人类原发恶性肿瘤和肿瘤系株中，故p16基因又称为多肿瘤抑制基因(MTS1)。p16蛋白表达的丢失贯穿于肺癌发生发展的整个过程中，不能简单地概括为早期或晚期事件。细胞一旦发生癌变，即可检出p16高频率丢失，随着癌细胞的增殖、转移的发生和病程的进展，p16丢失加剧。因此，p16既可能作为早期诊断癌变的指标，也可被用于判断病期早晚和是否发生转移，或被用于评估预后。
三、端粒酶(Telemerase)
端粒酶是一种RNA依赖性的DNA聚合酶，它的激活可在染色体末端分成端粒，使细胞避免衰和死亡，获得无限增殖能力，从而导致肿瘤的发生。近年的研究表明，端粒酶本身由端粒RNA成分(hTR)、端粒酶逆转录酶(hTERT)和端粒相关蛋白1(TEP1)3个亚单位组成，其中hTERT是端粒酶的催化亚单位，对端粒酶活性起着重要作用。刘允等采用定量测试方法对端粒酶免疫组织学染色结果进行定量分析。结果表明，肺鳞癌与腺癌的端粒酶表达的阳性率差异无显著性，肺鳞癌及腺癌组织与非肿瘤性肺实质的端粒酶表达的阳性率均有显著性差异。hTERT在肺癌组织中的表达明显高于肺非肿瘤组织。有研究发现，端粒酶的活性变化发生于肺癌的早期阶段，因此端粒酶的定量测试及分析有可能成为肺癌癌前病变及早期诊断的辅助诊断指标之一。端粒酶的激活是细胞走向永生化的必要途径，而永生化又被认为是肿瘤恶化的必要步骤，进而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生存。对于端粒及端粒酶在肿瘤中的进一步研究主要应集中在以下几个方面:①端粒和端粒酶的高级结构及其结合蛋白的功能;②端粒和端粒酶的分子克隆及相关的分子激活调控机制;③寻找端粒酶的专一性抑制剂及其在抗肿瘤中的应用;④解决维持端粒的其他途径— — —选择性端粒延长途经(alternative lengthening of telomeres，ALT)，干扰端粒酶抑制剂对肿瘤的治疗问题;⑤有人提出，针对端粒的靶向治疗可能比针对端粒酶的靶向治疗更适合。这一系列的研究进展，也将为肺癌治疗及抗肺癌新药的开发提供新思路及良好的应用前景。
四、耐药基因
(一)MDR1基因
P-gp是一种跨膜糖蛋白，由MDR1基因编码，MDR1与肿瘤的多药耐药有关。在肿瘤细胞中存在MDR1基因过度表达，P-gp通过ATP供能，将药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞耐药，使药物无法对肿瘤细胞有效杀伤而引起多药耐药现象。P-gp阳性者容易对阿霉素类、长春碱类、VP-16、紫杉醇及多西紫杉醇等疏水亲脂类抗癌药物产生耐药。肺癌细胞同样存在MDR1基因过度表达，而且这种过度表达与肺癌化疗耐药密切相关。李国仁等用免疫组化法测定60例未经化疗的肺癌标本，发现24例肺癌组织中有P-gp表达，且明显高于癌旁肺组织(P＜0.001)。经过对43例未经化疗的NSCLC的研究发现，MDR1基因及其表达蛋白Pgp在肺癌组织中呈广泛表达，与癌旁组织相比有显著性差异(P＜0.05)，说明MDR1、P-gp作为反映肿瘤经典耐药的指标在研究NSCLC耐药中仍然占有重要地位。免疫组织化学提示，P-gp在肺腺癌中的表达较高(93.33%)，与肺鳞癌中的表达(66.67%)相比有显著性差异(P＜0.05)。在阳性表达的标本中，40.00%的肺腺癌为强阳性表达，仅有22.22%的肺鳞癌为强阳性，推测P-gp可能作为一个原发耐药的因素导致临床上肺腺癌的化疗效果比肺鳞癌更差。
(二)MRP基因
MRP与P-gp在结构和功能上有许多相似之处，也是一种依赖能量的药泵，MRP家族成员目前最少已有8种(MRP1～MRP8)。MRP作用机制与P－gp表达无关，而与细胞内MRP的药物泵作用有关。它能识别和转运与谷胱甘肽(glutathione，GSH)结合的底物，故又称为GSH-X泵，从而降低细胞内的药物浓度，增加药物外流产生耐药。MRP阳性者易对阿霉素类、长春碱类等抗癌药物产生耐药。MRP在NSCLC中的表达阳性率研究结果不一，Chuman等发现，在原发性肺鳞癌中MRP的阳性率达到了89%，Heenan等的实验显示，39%的肺癌有MRP表达，导致检测结果不一的原因可能和所采用不同克隆号的抗体有关。我们的实验运用MRP1作为检测耐药蛋白的标记物之一，发现未经化疗的NSCLC细胞MRP1原发表达的总阳性率为67.44%，不同肿瘤类型及临床分期之间无显著性差异，与肺癌是否有淋巴结转移也无相关，在腺癌及鳞癌中主要为中等程度表达。因此我们认为，MRP的过表达与NSCLC多药耐药的相关程度和所选择的抗体亚型密切相关，还需要有进一步的研究证实。Brooks等发现，许多肺癌组织同时表达MRP和MDR1，但后者表达较低，故认为MRP较MDR1可能是反映MDR更好的指标。
正如肿瘤发生要经历多基因、多阶段作用，肿瘤耐药亦是多因素参与的过程。单纯以某一耐药基因为指标探讨其临床意义，势必以偏概全。本组43例NSCLC化疗前20例(46.51%)有不同程度MDR1、MRP和LRP共表达，支持肿瘤耐药的多基因学说;而且，我们对同一患者的肺癌耐药基因及其表达蛋白进行了对比研究，发现患者耐药基因及其蛋白的表达密切相关，提示以上3种指标无论是从基因水平还是分子水平来研究肺癌多药耐药都有很好的相关性。有几例标本基因及其蛋白表达不相符合，推测实验误差为其原因之一。但是否还存在其他基因参与了耐药蛋白表达的调控，这些还需要进一步的实验证实。
五、血管形成及转移相关基因
血管内皮生长因子(VEGF)
VEGF是PDGF家族的成员，序列高度保守，人体细胞分泌4种VEGF多肽，选择性作用于血管内皮细胞膜上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体，能高效、特异地促血管内皮细胞有丝分裂。KDR是血管形成的主要调控分子，具有明显的化学趋化和促分裂作用，与血管岛、血管形成和造血有关;而Fltl主要在内皮细胞排列形成管腔时发挥作用，VEGF及其受体通过这种旁分泌途径联合调控内皮细胞分化、血管形成。
VEGF是目前已知的作用最强的促血管生成因子，能刺激肿瘤新生血管内皮细胞增殖，促进微小静脉通透性的增加，诱导血管形成。NSCLC患者VEGF的表达强度与微血管密度(MVD)值之间存在显著正相关。有研究表明，VEGF在NSCLC中的阳性率与患者的年龄、性别、病理组织学之间无关，而与TNM分期及分化程度有关，分期越晚、分化程度越低其阳性率越高。VEGF参与肺癌浸润与转移机制可能是通过促血管生成及通过旁分泌、自分泌，故VEGF及其受体(VEGFR)被认为是最有前途的抗肿瘤血管生成靶点，为抗VEGF治疗提供了理论依据。Bevacizumab(一种人源化抗VEGF单克隆抗体)，在临床试验中所取得的可喜疗效说明抗VEGF治疗具有良好的应用前景。现已证实，在肺癌组织中有VEGF及其受体的表达，且与肿瘤血管计数有关，VEGF可作为肺癌转移的临床监测指标;肺癌组织和血液中均有VEGF水平升高，血液中VEGF水平也可作为判定肿瘤分期、预后的标记物。
肺癌分子标记物是与肺癌相关联的基因的异常，它能反应肺癌细胞处于癌变早期(启动)阶段的变化，可用于早期诊断。应用分子生物学方法检测肺癌相关基因的存在与否，分析基因的缺陷和类型及其表达功能是否正常，以帮助肺癌的诊断、分型、监视病情、判断预后，均为肺癌分子标记物及基因诊断研究的内容。基因的异常表现可分别由DNA、RNA及蛋白质三个水平测知。肺癌分子标记物特异性及灵敏性好，可直接提供基因水平变异的信息。但其检测方法较为复杂，临床使用可行性不如肺癌血清标记物。目前，只是血清标记物的补充，不能替代血清标记物的检测。但如联合应用可全面评价肺癌发生、发展及提高诊断效率。
在各种肺癌标记物中，适用于NSCLC的有CYFRA21-1、SSC Ag、CA125、CA242、CD44、K-ras基因、c-erbB-2基因、p16基因;适用于SCLC的有NSE、NCAM、myc基因、Rb基因。
六、肺癌分子标记物的临床应用
分子生物学研究表明，肺癌的发生发展是多阶段、多基因调控的过程，存在多种分子异常和积累。肺癌的发生发展过程大致可以分为不可逆的启动(iniiation)，可逆的促进(promotion)、进展(progression)和不可逆的侵袭转移等几个阶段。启动阶段是环境致癌物引起DNA突变的阶段，是快速、不可逆的过程。启动是致癌过程的关键性阶段，是癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活的结果，是肺癌发生的早期事件。促进阶段是一个漫长的发展过程，可长达10年。促进阶段同样受某些生长因子基因、癌基因和抑癌基因的调控，这些因素的改变促进细胞的分裂增殖。促进阶段是可逆的，可因施加某些因素而受到抑制。如果促癌阶段未能被阻止，这些细胞继续发展下去成为癌细胞，即进入进展期。该期是已形成的肿瘤细胞恶性程度进一步增加阶段，其中包括获得侵袭和转移能力等恶性特征的过程，也涉及一系列基因的变化。在肺癌发生发展过程中所涉及的各种分子生物学的变化可能作为肺癌的分子标记物从基因水平为肺癌的早期诊断、预后判断提供帮助。
(一)早期诊断
20世纪70年代以来，美国国立癌症研究院(NCI)组织了大规模临床试验，对X线片加痰细胞学检查作为肺癌普查手段进行了评价。结果表明，虽然有助于发现有切除可能的早期肺癌，但肺癌死亡率并未降低。因此，如何将肺癌分子生物学的知识和技术用于肺癌的早期诊断成为当今研究的热点。
肺癌癌变的多阶段学说在临床上的表现是癌症尚未发现以前往往有一个相当漫长的癌前期过程。在鳞癌中，发生于支气管上皮的癌前病变是指癌细胞浸润气管上皮组织之前的变化，包括增生、化生、发育异常和原位癌;在周围型肺腺癌，则为非典型性腺样增生(atypical adenomatoushyperplasia，AAH);SCLC尚未发现癌前病变。癌前病变是支气管上皮细胞中分子生物学异常的形态学表现。这些癌前病变的细胞和邻近肿瘤的支气管上皮细胞中包含了癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，并伴有其他许多遗传学的改变。这些改变同肺癌细胞中存在的基因异常相一致，说明癌前病变分子异常的不可逆性和延续性。1998年，Minna通过前瞻性地对肺癌发生发展过程中分子病理学研究，提出一整套基因变化模式:即3p基因丢失(FHIT基因转录缺失)→9p基因丢失(p16基因甲基化或缺失)→ras基因突变→原癌基因(p53，17q13.3基因突变)→肺癌侵袭和转移(p15，p16，c-erbB-2，EGFR基因突变)。因此，运用分子生物学的方法去检测早期基因及分子的改变，从而发现癌前病变或早期癌已有可能变为现实。
(二)判断预后
运用现代分子生物学理论和技术的研究成果，对肺癌患者手术切除的肿瘤组织、淋巴结、手术切缘组织及外周血等标本检测某些肺癌分子生物学标记物，来评估肺癌的恶性程度、复发转移的危险度、疗效判断，以补充病理组织分型及临床分期的不足，更准确的判断患者预后，称为肺癌的分子分期和分子预后。
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