的测定（，－二硝基苯肼法

实验五　果蔬维生素C（抗坏血酸）的测定（2，4－二硝基苯肼法）

一、实验目的与要求

1．了解测定食物中维生素C的意义。

2．掌握测定食物中维生素C的化学显色方法。

3．了解影响食物中维生素C含量的因素。

二、实验原理

1．总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4－二硝基苯肼作用生成红色脎，脎的含量与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。

2．适用范围　根据GB　12392—1990进行检测。本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。

三、实验仪器与试剂

1．仪器

（1）恒温箱：（37±5）℃；

（2）可见－紫外分光光度计；

（3）打碎机。

2．试剂　本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯级。

（1）4．5mol／L H₂SO₄：谨慎地加250ml硫酸（相对密度1．84）于700ml水中，冷却后用水稀释至1　000ml。

（2）85%H₂SO₄：谨慎地加900ml硫酸（相对密度1．84）于100ml水中。

（3）2%2，4－二硝基苯肼溶液：溶解2g　2，4－二硝基苯肼于100ml　4．5mol／L H₂SO₄内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤。

（4）2%H₂C₂O₄溶液：溶解20g草酸于700ml水中，稀释至1　000ml。

（5）1%H₂C₂O₄溶液：稀释500ml　2%草酸溶液到1　000ml。

（6）1%硫脲溶液：溶解5g硫脲于500ml　1%草酸溶液中。

（7）2%硫脲溶液：溶解10g硫脲于500ml　1%草酸溶液中。

（8）1mol／L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1　200ml。

（9）活性炭：将100g活性炭加到750ml　1mol／L盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3＋）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

（10）标准液

①抗坏血酸标准溶液（1mg／ml）：溶解100mg纯抗坏血酸于100ml　1%草酸溶液中。

②标准曲线绘制：加1g活性炭于50ml标准溶液中，摇动1min，过滤。取10ml滤液放入500ml容量瓶中，加5．0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为20μg／ml。取5、10、20、25、40、50、60ml稀释液，分别放入7个100ml容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1、2、4、5、8、10、12μg／ml。

按样品测定步骤形成脎并比色。

以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg／ml）为横坐标绘制标准曲线。

四、实验步骤

全部实验过程应避光。

1．样品制备

（1）鲜样制备：称100g鲜样和100g　2%草酸溶液，倒入打碎机中打成匀浆，取10～40g匀浆（含1～2mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

（2）干样制备：称1～4g干样（含1～2mg抗坏血酸）放入研钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

（3）将上述两液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。

2．氧化处理　取25ml上述滤液，加入0．5g活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10ml此氧化提取液，加入10ml　2%硫脲溶液，混匀。

3．呈色反应

（1）于3个试管中各加4ml稀释液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1．0ml 2%2，4－二硝基苯肼溶液，将所有试管放入（37±0．5）℃恒温箱或水浴中，保温3h。

（2）3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入1．0ml　2%2，4－二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min后放入冰水内。其余步骤同样品。

（3）85%硫酸处理：当试管放入冰水后，向每一试管中加入5ml　85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。

（4）比色：用1cm比色杯，以空白液调零点，于500nm波长测吸光值。

五、实验结果与分析

同荧光法。

六、实验报告

七、注意事项

1．大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。

2．若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。

3．试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30min应准时比色。