水溶性维生素负荷试验

实验二十一　水溶性维生素负荷试验

一、实验目的与要求

掌握用负荷实验评价人体水溶性维生素的营养状况的原理和方法。

二、实验原理

1．水溶性维生素进入人体后的主要排泄途径是经尿液排出，体内水溶性维生素的营养状况越好，摄入的水溶性维生素随尿液排出的就越多，因此通过检测尿中水溶性维生素的水平，可以间接评价水溶性维生素在体内的营养状况。水溶性维生素负荷尿试验就是给受试者服用一定剂量的水溶性维生素，测定一定时间内受试者尿液中水溶性维生素或其代谢产物的排出量，来评价水溶性维生素的营养状况。

2．含有核黄素的溶液在紫外线下发黄绿色荧光，在稀溶液中荧光强度与核黄素浓度成正比。核黄素又可被低亚硫酸钠还原而失去荧光，故测定还原前后的荧光强度可以去除干扰性荧光物质的影响。

三、实验仪器与试剂

1．仪器　930型荧光光度计（或其他型号的荧光光度计）。

2．试剂

（1）酸性水：取浓硫酸0．3ml，加蒸馏水至200ml。

（2）核黄素标准储备液：精确称取25mg核黄素于1　000ml容量瓶中，用酸性水稀释至刻度，移至棕色瓶中，冷藏备用。

（3）核黄素标准应用液：吸取上清4ml，用酸性水稀释至100ml，临用时配。

（4）低亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）。

四、实验方法与步骤

1．样品　取尿样1ml加酸性水19ml于一具塞试管内，混匀，在激发波长420nm和发射波长530nm测定荧光强度。记下读数（A）后，取10mg低亚硫酸钠直接加入比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并记下读数（B）。

2．内标准　取尿样1ml加核黄素应用液1．5ml，加酸性水17．5ml，混匀，在同样条件下测定荧光强度。记下读数（C）后，取10mg低亚硫酸钠直接加入比色杯内，摇匀，立即测定荧光强度并记下读数（D）。

五、实验结果与分析

式中：C₁———尿中核黄素含量（μg）；

　　　c———内标核黄素含量（μg）；

　　　V———尿液总量（ml）；

　　　v———分析用尿量（ml）。

评价标准：≤400μg，为核黄素缺乏

　　　　　400～799μg，为不足

　　　　　800～1　300μg，为正常

六、注意事项

1．所有操作需在暗室内进行。

2．做内标准的目的是除去尿样中可能存在的荧光物质。

3．在使用荧光光度计时应用荧光红钠校正。

荧光红钠溶液的配制：溶解25．0mg荧光红钠于少量水中，搅拌使其溶解后加水至250ml，此液为储备液。取储备液0．25ml加水稀释成250ml，为工作液。

校正步骤：现选择所需激发波长和发射波长，校正仪器零点，然后以荧光红钠工作液校正荧光计使指针在某一刻度，再测定样品的荧光强度。

4．如遇尿样浑浊，难以直接读数，可将尿样按上述方法稀释后，过硅镁层析柱后再进行测定。

七、实验报告

八、注意事项

1．试剂为空白对照；

2．每组样品做2～3个平行实验。