增强免疫力功能试验

实验三十三　增强免疫力功能试验

一、实验目的与要求

1．熟悉动物实验的操作技术与要求；

2．掌握增强免疫力功能检验与评价的方法。

二、实验原理

1．免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。健全的免疫系统主要有三大功能：

（1）防御功能———保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；

（2）稳定清洁功能———不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；

（3）监控功能———及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。

2．机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。

三、实验仪器与试剂

1．仪器

（1）200目筛网；

（2）24孔培养板；

（3）96孔培养板（平底）；

（4）玻片架；

（5）微量血凝实验板；

（6）血色素吸管；

（7）手术器械；

（8）打孔器；

（9）计时器；

（10）二氧化碳培养箱；

（11）超净工作台；

（12）恒温水浴；

（13）离心机；

（14）酶标仪；

（15）721型分光光度计；

（16）显微镜。

2．试剂

（1）生理盐水；

（2）丙酮；

（3）甲醇；

（4）盐酸；

（5）异丙醇；

（6）二硝基氟苯（DNFB）；

（7）麻油；

（8）硫化钡；

（9）Na₂CO₃；

（10）RPMI1640细胞培养液；

（11）小牛血清；

（12）2－巯基乙醇（2－ME）；

（13）青霉素；

（14）链霉素；

（15）刀豆蛋白A（ConA）；

（16）Hanks液；

（17）PBS缓冲液（pH　7．2～7．4）；

（18）SA缓冲液；

（19）琼脂糖；

（20）印度墨汁；

（21）绵羊红细胞（SRBC）；

（22）鸡红细胞；

（23）YAC－1细胞；

（24）补体（豚鼠血清）；

（25）MTT（一种淡黄色的唑氮盐）；

（26）Giemsa染液；

（27）乳酸锂或乳酸钠；

（28）硝基氯化四氮唑（INT）；

（29）吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）；

（30）氧化型辅酶Ⅰ（NAD）；

（31）0．2mol／L的Tris－HCl缓冲液（pH　8．2）；

（32）1%NP40或2．5%Triton。

四、实验方法与步骤

1．样品处理与给予方式

（1）对于水溶性样品，用蒸馏水配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物；对于脂溶性样品，用调和油配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物。

（2）受试样品推荐量较大，超过实验动物的灌胃量、加入饮水或掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品中的非功效成分的含量。

（3）对于含乙醇的受试样品，原则上应使用其定型的产品进行功能实验，其三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。如受试样品的推荐量较大，超过动物最大灌胃量时，允许将其进行浓缩，但最终的浓缩液体应恢复原乙醇含量。如乙醇含量超过15%，允许将其含量降至15%。调整受试样品乙醇含量应使用原产品的酒基。

（4）液体受试样品需要浓缩时，应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择60～70℃减压进行浓缩。浓缩的倍数依具体实验要求而定。

（5）对于以冲泡形式饮用的受试样品（如袋泡剂），可使用该受试样品的水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取的条件：常压，温度80～90℃，时间30～60min，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需浓度。

（6）必须经口给予受试样品，首选灌胃。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。

（7）以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。

2．动物实验

（1）动物选择：推荐用近交系小鼠，20g±2g，单一性别，每组10～15只。

（2）剂量分组：实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组，另设两个剂量组，必要时设阳性对照组。

（3）样品给予时间：所有试验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。给予受试物的灌胃体积为20ml／（kg·BW）。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。

3．指标检测

（1）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）

①试剂配制

a．完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol／L），青霉素（100U／ml），链霉素（100μg／L）及5×10^－5　mol／L的2－巯基乙醇，用无菌的1mol／L的HCl或1mol／L的NaOH调pH至7．0～7．2，即完全培养液。

b．ConA液：用双蒸水配制成100μg／ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（－20℃）中保存。

c．无菌Hanks液：用前以3．5%的无菌NaHCO₃调pH至7．2～7．4。

d．MTT液：将5mg MTT溶于1ml pH　7．2的PBS中，现配现用。

e．酸性异丙醇溶液：96ml异丙醇中加入4ml　1mol／L的HCl，临用前配制。

②脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r／min）。然后将细胞悬浮于1ml完全培养液中，用溴酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×10⁶个／ml。

③淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液（相当于7．5μg／ml），另一孔作为对照，置5%CO₂，37℃CO₂孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0．7ml，加入0．7ml不含小牛血清的RPMI　1640培养液，同时加入MTT（5mg／ml）50μl／孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2ml比色杯中，721型分光光度计上在波长570nm测定OD值。

（2）二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）

①DNFB溶液的配制：DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB　50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5ml丙酮麻油溶液（丙酮∶麻油＝1∶1）倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μl注射器通过瓶盖取用。

②致敏：每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。

③DTH的产生与测定：5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

（3）抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）

①SRBC：绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

②制备补体：采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1ml压积SRBC加入5ml豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA液按1∶（8～15）稀释。

③玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0．5g琼脂糖加双蒸水至100ml，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。

④免疫动物：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2　000r／min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC　5×10⁷～2×10⁸个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%（V／V）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0．2ml。

⑤脾细胞悬液制备：将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1　000r／min）10min，用Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml RPMI　1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶个／ml。也可将细胞悬浮在8ml Hanks液，测定脾空斑形成数。

⑥空斑的测定：将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100ml）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH　7．2～7．4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0．5ml，再向管内加50μl　10%SRBC（V／V，用SA液配制），20μl脾细胞悬液（5×10⁶个／ml）或25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1～1．5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（1∶8）加到玻片架凹槽内，继续温育1～1．5h后，计数溶血空斑数。

（4）血清溶血素的测定（血凝法）

①SRBC：绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

②免疫动物及血清分离：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2　000r／min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%（V／V）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0．2ml进行免疫。4～5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2　000r／min离心10min，收集血清。

③凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100μl，再加入100μl　0．5%（V／V）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。

血清凝集程度一般分为5级（0～Ⅳ）记录，按下式计算抗体积数，受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体水平，可判定该项实验结果阳性。

抗体水平＝（S₁＋2S₂＋3S₃＋…＋nS_n）

式中1、2、3…n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级：红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。

Ⅰ级：红细胞大部分沉积在孔底成圆点状，四周有少量凝集的红细胞。

Ⅱ级：凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

Ⅲ级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。

Ⅳ级：凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

（5）小鼠碳廓清实验

①溶液配制

a．注射用墨汁：将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。

b．Na₂CO₃溶液：取0．1g Na₂CO₃，加蒸馏水至100ml。

②注射墨汁：称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0．1ml计算。待墨汁注入，立即计时。

③测定：注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml 0．1%Na₂CO₃溶液中。用721型分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na₂CO₃溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按下列公式计算吞噬指数：

（6）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）

①鸡红细胞悬液制备：取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2～3次，离心（2　000r／min，10min），去上清，用生理盐水配成20%（V／V）的鸡红细胞悬液。

②吞噬功能测定：每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1ml。间隔30min，颈椎脱臼处死动物，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%（V／V）Giemsa－磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干，每张片由镜下观察100个巨噬细胞，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：

在计数时，应同时观察鸡红细胞被消化的程度。借以判定巨噬细胞吞噬与消化功能，通常分为4级：

Ⅰ级：未消化。被吞噬的鸡红细胞完整，胞质浅红或浅黄带绿色，胞核浅紫色。

Ⅱ级：轻度消化。胞质浅黄绿色、胞核固缩呈紫蓝色。

Ⅲ级：重度消化。胞质淡染，胞核淡浅灰色。

Ⅳ级：完全消化。巨噬细胞内仅见形态类似鸡红细胞大小的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。

（7）NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）

①乳酸脱氢酶LDH基质液的配制

乳酸锂5×10^－2　mol／L

硝基氯化四氮唑（INT）6．6×10^－4　mol／L

吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）2．8×10^－4　mol／L

氧化型辅酶Ⅰ（NAD）1．3×10^－3　mol／L

将上述试剂溶于0．2mol／L的Tris－HCl缓冲液中（pH　8．2）

②靶细胞的传代（YAC－1细胞）：实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个／ml。

③脾细胞悬液的制备（效应细胞）：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hanks液洗2次，每次离心10min（1　000r／min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0．5ml灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0．5ml　2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，1　000r／min，10min离心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用溴酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI　1640完全培养液调整细胞浓度为2×10⁷个／ml。

④NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100μl（效靶比50∶1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40或2．5%Triton各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO₂培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1　500r／min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol／L的HCl　30μl，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。

按下式计算NK细胞活性：

五、实验结果与分析

增强免疫力功能判定　在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力功能。

1．细胞免疫功能结果判定　细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。

2．体液免疫功能结果判定　体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。

3．单核－巨噬细胞功能结果判定　单核－巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核－巨噬细胞功能结果阳性。

4．NK细胞活性结果判定　NK细胞活性测定实验的两个剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。

六、注意事项

1．MTT法测定ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验时，选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。

2．二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应操作时，应避免DNFB与皮肤接触。

3．血清溶血素的测定时，血清稀释要充分混匀，最后一个稀释度应不出现凝集现象。

4．小鼠碳廓清实验测定时，静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确；墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀；使用新的墨汁时，应在实验前摸索出一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20～30min内不易廓清，而激活的小鼠可明显廓清。

5．NK细胞活性测定时，靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95%；比色时环境温度应保持恒定；LDH基质液应临用前配制；在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比，一般效靶比值不应超过100∶1。