心血管细胞和分子生物力学

第八节　心血管细胞和分子生物力学

一、细胞对力学信号的响应

力学因素在各种组织、细胞中起重要的调控作用：①影响细胞和组织的行为如骨的吸收和形成；②骨骼肌的分化；③心肌细胞的肥大；④成纤维细胞的分化。另外，力学因素还能产生多种第二信使，如激活蛋白质的磷酸化、激活蛋白激酶和多种信号转导通路。对干细胞施加一定的拉伸应变后，应变能促进干细胞胞内Ca²⁺浓度的显著增高。胞内Ca²⁺的增加主要以胞外Ca²⁺的内流为主，这提示拉伸应变能激活干细胞胞膜上的有关Ca²⁺通道。当胞外Ca²⁺被螯合后，拉伸应变不能使胞内Ca²⁺浓度增加，其原因可能因为胞内Ca²⁺浓度的增高需要胞内Ca²⁺库和胞外Ca²⁺的同时参与，缺乏胞外Ca²⁺的内流，胞内Ca²⁺库对Ca²⁺的释放非常有限，其具体原因还有待进一步研究证实。

钙离子在细胞的生长、分化及信号传导等生物学功能方面起重要作用。机械力能促进成骨细胞内Ca²⁺水平的增加，Ca²⁺作为第二信使将力学信号传导至细胞内，引起一系列信号级联反应。钙火花（Ca²⁺spark）是Ca²⁺信号传递的一种表现形式。

干细胞对力学信号的感知并将该信号转化为生物学信号，引起一系列生物学反应的过程是极其复杂的事件，认识力学信号的转导机制是阐明力学偶联（mechanocoupling）机制的重要环节。目前，虽然有关力学信号传导机制研究的报道较多，但由于使用的细胞不同，加载力的方式不同，其结果有明显的差异。

微丝是细胞感应机械力的主要细胞骨架结构，胞膜上Ca²⁺通道或力敏感离子通道的启闭与细胞微丝结构的完整性有密切关系。当细胞微丝结构被破坏后，拉伸应变延迟了胞内Ca²⁺水平的增加。其原因可能是细胞微丝被破坏后，细胞不能快速感应机械力对细胞的刺激，从而不能使胞膜表面的受体或离子通道立刻开启，延迟了胞外Ca²⁺的内流和胞内Ca²⁺库对Ca²⁺的释放。细胞受到拉伸应变后，胞内Ca²⁺的这种短暂增加是力学信号转化为生物学信号的一种表现形式，但Ca²⁺的大量释放并不与拉伸应变的幅度和拉伸时间的延长呈正相关。在一定的拉伸强度和时间范围内应变能促进胞内Ca²⁺的释放，其原因有待进一步研究。

钙火花是细胞肌质网上钙释放通道（RyR）自发开放或L型钙通道开放触发引起的局部钙释放时的事件，钙火花事件是细胞Ca²⁺信号传导的另一种表现形式。钙火花的发生具有时空效应，即钙火花的触发呈随机性。在正常情况下RyR对胞内的钙敏感性低，它产生钙火花的机会较低，当L型钙通道开放时能促进RyR钙的释放，增加钙火花产生的频率。关于细胞产生钙火花的事件在心肌细胞、骨骼细胞和神经细胞中有大量的研究报道，但是干细胞定向诱导分化中关于钙火花分子事件尚未见相关报道。本研究结果显示，3%的应变拉伸2min能激发干细胞产生钙火花事件，微丝结构破坏后延迟了钙火花事件的发生。其原因可能由于细胞受到拉伸应变后，应变激活了胞膜上的Ca²⁺通道和力敏感离子通道，它们的瞬间开放使大量的胞外Ca²⁺内流，胞内Ca²⁺浓度的突然升高又使胞内Ca²⁺库中的Ca²⁺释放，两者共同作用诱发干细胞产生钙火花。微丝是细胞感知力学信号的重要单位，细胞微丝结构的破坏延迟了应变胞外Ca²⁺的内流。深入研究拉伸应变在干细胞定向分化过程中能激发其产生钙火花的机制，对进一步认识力学因素在干细胞定向分化中的作用有重要的生物学意义。

大量研究表明，力学因素对细胞的生长、增生、分化有非常重要的影响，但对于细胞如何将力学信号转化为生物学信号，人们还了解甚少。探讨力学信号的传导机制是进一步认识生命活动规律的一个重要研究领域。有研究者选用5种不同的细胞信号通路阻断剂，研究拉伸应变在间充质干细胞向成骨细胞分化过程中力学信号可能的传导途径，表明诱导组加入相应的阻断剂后，与成骨细胞分化有关的基因OSX和其标记物OCN的表达被完全抑制。其中的原因是因为地塞米松在成骨细胞的分化中，主要通过丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路对细胞产生级联生物学反应，当MAPK途径被抑制后，地塞米松无法将其信号传递到细胞内，从而不能使OSX和OCN基因表达。PI3Ks是一类磷酸化的磷脂酰肌醇和其衍生物，磷脂酰肌醇在细胞信号传导中起重要的作用，结果显示用PI3Ks信号阻断剂能抑制成骨细胞诱导体系对干细胞向成骨细胞的诱导分化。细胞骨架结构在细胞信号传导中也发挥重要作用，整联蛋白（integrin）是细胞内重要的信号传递物质基础。Ca²⁺作为胞内第二信使能将胞外各种不同的信号传递到胞内，当胞外Ca²⁺被螯合后，胞外Ca²⁺不能发生内流，从而影响力学信号传导。

用p38MAPK的特异性抑制剂后，显示拉伸应变能激活细胞OSX和OCN基因的表达，说明在力学信号的传导中，p38MAPK信号通路并不是其主要的途径。Craig等研究表明抑制p38MAPK能促进成骨细胞的分化。但也有相反的研究报道应变能激活p38MAPK，其原因可能是所用的细胞不同或力学加载方式不同所致。信号调节激酶（ERK）-1/2通路能被各种力学信号激活。Jessop等利用应变和切应力载荷成骨细胞均能激活ERK-1/2，但单独用切应力以及用机械应变与切应力共同作用于细胞时，对ERK-1/2的激活有不同的结果。Simmons等利用等轴循环应变（3%，0.25Hz）诱导间充质干细胞（MSC）向成骨细胞分化时发现用应变作用hMSC不同时间后，应变激活了MAPK和p38信号通路。利用ERK-1/2MAPK的特异性抑制剂作用细胞后，拉伸应变能激活细胞OSX和OCN基因的表达。即使ERK-1/2MAPK信号通路被阻断后，力学信号同样能促进干细胞向成骨细胞方向分化，这可能由于OSX和OCN的表达调控与ERK-1/2MAPK信号通路无密切关系。

PI3Ks信号通路主要与G蛋白信号有密切的关系，同时与胞内Ca²⁺的释放有一定的联系。当阻断PI3Ks时，拉伸应变能部分激活细胞OSX和OCN基因的表达。其原因可能因PI3Ks信号通路也是传导力学信号的一个途径，依据主要有两方面：一是当ERK-1/2MAPK和p38MAPK被阻断后，载荷仍能促进与成骨细胞分化相关的基因OSX和OCN的表达，说明PI3Ks信号通路参与了力学信号的传导；二是由于当细胞微丝结构被破坏或胞外Ca²⁺被破坏后，应变加载的细胞不能使Ca²⁺内流，从而抑制了OSX和OCN基因表达。

细胞骨架微丝不仅是维持细胞形态和功能的基础，同时也是细胞感受力学刺激的重要感应器。利用细胞松弛素B破坏细胞微丝结构并给细胞加载拉伸应变后，结果显示拉伸应变不能激活OSX和OCN基因的表达，其原因可能因微丝结构破坏后细胞不能感应力学信号有关。

Ca²⁺信号是细胞重要的信号传导途径之一，其中胞外Ca²⁺的内流是胞外信号传导的主要方式。有研究表明用胞内Ca²⁺抑制剂TMB（trimethoxybenzoate hydrochloride）能降低拉伸应变激活ERK-1/2的功能。Malviya等研究证实，对成骨细胞加载应变后，应变能促进胞内Ca²⁺水平的升高，胞内Ca²+水平的增加同胞膜上L型钙离子通道开放和胞核内Ca²⁺的释放有密切关系。利用EGTA（乙二醇双四乙酸）螯合Ca²⁺后加载应变实验结果表明，应变不能使OSX和OCN基因表达，这可能是由于应变即可使胞膜上L型钙离子通道开放，但无Ca²⁺的内流而不能激活相关基因的表达。

综上所述，Ca²⁺信号在力学信号传导方面可能发挥主要的作用，干细胞向成骨细胞定向分化过程中，力学信号的传导主要通过细胞Ca²⁺信号通路、PI3Ks信号通路及同细胞骨架微丝结构的完整性有密切关系。

二、分子动力学模拟

在传统计算力学的研究领域，利用Fluent等软件实现连续介质流体的模拟，已有很成熟的经验及范例；同时，分子动力学模拟也在其擅长的微观结构分析及预测领域有了长足的发展。但到目前为止，连续介质力学仍无法和分子动力学方法有机地结合起来。因此，仍无法在分子动力学模拟体系构建理想的（即速度梯度和温度可控的）切应流场。

Grattona与Delgado-Buscalioni等的研究表明，在分子动力学模拟中，利用经典力学中的流场模型，在原子尺度下定义的经验势场里同样可以形成流场。有研究组之前采用伊利诺伊州大学Schulten研究组开发的SMD（steered molecular dynamics）方法建立了流场，但未能较好地模拟所期望的线性速度场。Chen等利用恒力驱动固定区域中水分子的方法建立了流场，但该流场也有很多不足之处，如流速随模拟时间的增加而增大、温度随模拟时间的增加而升高且变得不稳定等。NAMD程序包括因其具有很好的并行性、开放性，以及与其他程序的兼容性，该程序得到了广泛应用。基于NAMD软件的Tcl接口并采用TclBC方法，该研究组编制了相应的程序来自定义边界条件并且实时更新水分子的牵拉力以控制其速度值。水盒子底部的厚度为0.5nm的水分子层被固定。同时对水盒顶部厚度为0.5nm的水分子层以及一侧厚度为1.0nm的区域内的水分子施加驱动力，以保证在更新时间段内水分子的速度梯度与目标梯度保持一致。此次模拟中，目标速度场是线性的。水盒子的所有边界均设置为周期性边界条件。模拟结果表明，当模拟20ps后，无论是否在牵拉区域内，所得到的速度梯度场均与目标值符合较好。在未控制温度的情况下，切应流场的速度梯度最小可达到0.001ps；在控制温度时，切应流场的速度梯度最小可达到0.01ps。该模拟方法的初步结果将有助于发展构建控制任意流体速度场的相关技术，最终为应用分子动力学模拟方法研究速度场对生物分子结构变化动力学的影响提供一个有力工具。

三、力学生物学

力学生物学（mechanobiology）是研究力学环境（刺激）对生物体健康、疾病或损伤的影响，研究生物体的力学信号感受和响应机制，阐明机体的力学过程与生物学过程如生长、重建、适应性变化和修复等之间的相互关系的学科。人体处于力学环境之中，力学因素影响机体整体、器官、组织、细胞和分子各层次的生物学过程。血管重建受生物、化学和物理等多种体内外因素的影响。心血管系统是一个以心脏（机械泵）为中心的力学系统。血液循环过程包含着血液流动、血细胞和血管的变形、血液和血管的相互作用等，其中均蕴藏着丰富的力学规律。因此，力学因素在血管重建中的作用尤为重要。

心血管病包括高血压、动脉粥样硬化、卒中和心肌梗死等，这些心血管病都有共同的发病学基础和基本的病理过程，表现为心血管细胞迁移、肥大、增生和凋亡等，具有细胞表型、形态结构与功能的改变，即发生血管重塑（vascular remodeling）。血管重塑是指机体在生长、发育、衰老和疾病等过程中，血管为适应体内外环境的变化而发生的形态结构和功能的改变。心血管病发生的血管重塑，其本质都是机体对不同致病因素引起的心血管系统自稳态失衡的反应和应答，而维持心血管系统自稳态的物质基础是起调节功能的心血管活性物质。心血管活性物质包括调节心血管生长、发育、形态结构和功能活动的蛋白质、多肽、酶、生长因子、细胞因子、黏附分子和信息传递分子等。

研究表明，流体切应力与血管张力能调节心血管细胞成分，包括膜受体和整联蛋白、信号蛋白激酶、生长因子和细胞因子等心血管活性物质的变化，从而参与血管重塑过程，这些过程都与血栓形成、动脉粥样硬化和血管肥厚等心血管疾病有密切的关系，其中包含许多生物力学和生物学基础问题。血管疾病发病机制的生物力学研究主要是阐明力学因素如何产生生物学效应而导致血管重塑，从细胞分子水平深入了解心血管活动和疾病发生的本质。这些研究将为探讨心血管病发病机制和防治提供新的生物力学思路。

（张宇辉）

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