杨氏模量在心肌细胞分子生物学中的应用

第六节　杨氏模量在心肌细胞分子生物学中的应用

杨氏模量（Young’s modulus）由于其纳米级分辨率及三维动态观测细胞等突出优点近年来成为研究细胞力学特性的重要参数。借助于用AFM得到弹性曲线图，再用赫兹模型加以处理就可以得到杨氏模量。杨氏模量是反映细胞弹性的参数，映射的是细胞的力学特性。随着微观分子生物学的发展，杨氏模量在细胞中的测量已广泛应用于各类细胞。测量心肌细胞的杨氏模量可以研究病变心肌细胞的物理改变，有助于了解心脏疾病，尤其是心力衰竭及心肌梗死的病理变化，进一步研究疾病的诊断和治疗方法。

随着微观分子生物学的发展，越来越多的研究人员从分子层面研究生物的生理或病理机制。细胞是组成生物体的基本单位，细胞表面物理性质的微小改变就会引起生物体宏观的生理病理改变。反过来，生物体宏观的生理病理改变也往往伴随着微观细胞表面物理性质的改变。因此，通过研究细胞的力学特性可以进而了解生物体的生理病理状态，从而为一些疾病的诊断和治疗提供更多的依据。AFM以其测量杨氏模量时分辨率高、对细胞影响小、可行性强等独特优势成为测量杨氏模量的首选方法。

一、概述

1986年，德国科学家研制出了首台AFM；1989年，AFM第一次应用于细胞水平，开创了细胞微观研究的新领域。AFM工作时，连接在微悬臂上的探针尖端部的原子与细胞表面原子接触，针尖对细胞产生一个作用力，同时细胞对针尖有个反作用力，这个反作用力使与针尖连接的微悬臂产生位移，继而使投射在微悬臂上的激光信号产生偏转。位移偏转与这个作用力遵循胡克定律，通过光斑显示器收集信号的变化获取细胞的弹性曲线图，再利用赫兹模型加以处理得到细胞的杨氏模量，由此获得细胞力学特性的信息。

与传统方法相比，AFM具有以下优势：①纳米级分辨率使观察更细致，可用于定量观察样品的三维结构，且图像分辨率高。以往的传统方法只能观察二维层面的结构，也不能达到定量观测细胞表面超微结构的标准。这一方面，AFM与传统方法相比较是质的飞跃。②在测量过程中，由于探针与细胞表面产生的作用力是极微弱的原子力，所以这种方法对细胞的活性及生理状况基本没有影响或影响极其微弱。③操作简单，可行性强，易于推广。④适用范围广泛，AFM可以用于测量传统方式无法测量的液态环境下的活细胞的物理特性，所以可以动态反映细胞在生物体内的生理特征，而不只是局限于细胞静态下的某一特定生理状态。

二、杨氏模量的临床应用

杨氏模量又称弹性模量，是反映物体表面弹性的参数。1807年由英国科学家Thomas Young命名。开始主要应用于物理领域，现在已在医学领域越来越广泛的应用。样本的杨氏模量越大，样本越不容易发生形变，弹性越小。

人体内各组织的杨氏模量从高到低依次为骨头（1～1000kPa）、结缔组织和软骨（100～1000kPa）、软组织（10⁸kPa以上）。

杨氏模量是最能体现物质力学特性的元素。随着微观分子生物学的发展，杨氏模量在细胞中的测量已广泛应用于微生物细胞、心肌细胞、犬肾上皮细胞系（MDCK）细胞。孙嘉伦等利用AFM测量成骨细胞的杨氏模量发现，杨氏模量的大小与作用力刺激的时间和频率成正相关，与刺激结束后间隔的时间呈负相关。Balint等经AFM分析脑血管内皮细胞的二维图像得到其杨氏模量，发现甘露醇处理过的细胞的杨氏模量（0.93±0.04）小于未经处理的细胞杨氏模量（8.04±0.12），即处理后细胞弹性变大了。Cross等研究癌细胞的硬度发现，良性细胞比转移癌细胞硬30%左右。这一研究可应用于临床检测细胞的癌变性质。Chouinard等的研究显示，低密度脂蛋白与血管内皮细胞的弹性有密切关系。Martens等在研究肌球蛋白在细胞弹性改变的作用时发现，细胞在加阻凝蛋白后抑制剂0.5～1h后，其杨氏模量由正常细胞的19. 9kPa减低到7.9kPa，证明了肌球蛋白确实影响细胞的弹性。Lekka等分别比较高血压患者和糖尿病患者与正常人红细胞杨氏模量，结果显示，两种患者的红细胞弹性较正常人低，且变化与年龄相关。Lam等研究化疗药物对细胞的影响时用化疗药物分别处理急性淋巴细胞和急性骨髓细胞，结果发现，处理后的细胞的平均弹性模量为4.696kPa，远高于未经处理的细胞的弹性模量0.197kPa。此研究结果还显示，细胞硬度的改变与药物种类无关，与药物剂量密切相关。Cai等挑选抑制率高于50%的几种不同浓度的ART溶液，将Jurkat细胞分别置于这几种不同浓度的ART（青蒿酯）溶液中，24h后观测细胞的形态学和机械性能的改变。实验观测到，胞膜发生了改变且超微结构也变复杂了。利用AFM追踪单个细胞的机械性能发现单个细胞的杨氏模量从对照组的（0.648±0.037）kPa降低到实验组的（0.254±0.035）kPa，同时细胞的硬度增加了1.5倍。Cross等研究癌细胞的硬度发现，良性细胞比转移癌细胞硬30%左右，这一研究可应用于临床检测细胞的癌变性质。Steinhauser E研究高静水压对人骨力学性质的影响时将骨的一侧边置于300的作用力下10min，另一侧边作为对照，测得300MPa处理后的骨的杨氏模量为（200.7±38.7）MPa，对照组的杨氏模量为（186.5±34.3）MPa。

杨氏模量的测量虽然操作简单易行，但也受很多因素的影响，不同条件下测量出来的同一细胞的杨氏模量可能有很大的差别。因此，在实验前必须掌握这些影响因素才能在实验中提高测量的准确性。

（一）细胞的处理方式

叶等的研究发现，样本经固定后其杨氏模量较生理条件下大，黏液球菌用戊二醛固定后细胞弹性（1.34±0.66）kPa比正常情况下（0.25±0.18）kPa增加了4倍多，红细胞用甲醛溶液处理后的弹性（119.5±15）kPa比生理条件下（16.05±2.3）kPa增加了将近10倍。

（二）基底物的性质

吕氏等学者在研究不同刚度培养基上细胞黏附形变的数值计算时发现，细胞更容易亲近接近自身刚度的培养基。当细胞刚度一定时，黏附力随培养基刚度的增加而增大。Domke等在实验中得出，4种不同粗糙度的基底物上造骨细胞的弹性模量由高到低排序为钛（8.8kPa）、聚苯乙烯（7.5kPa）、玻璃（5.5 kPa）、钛钒（2.1 kPa）。Abu-lail和Camesano等在研究中发现，基底液的极性不同。同一种细胞的弹性模量也不同，极性越低，弹性模量越大。

（三）测量区域

Methur等用AFM测量脐静脉血管内皮细胞的杨氏模量，测量过程中发现核区胞膜的杨氏模量（7.22±0.46）kPa约为边缘区胞膜杨氏模量（1.27±0.36）kPa的6倍。Rotsch和Radmacher等的研究则表明，伸展区胞膜杨氏模量小于稳定区。

三、杨氏模量在心肌细胞中的应用

世界卫生组织的数据表明，起源于冠状动脉疾病的心力衰竭和心肌梗死在世界总死亡人数中的比例高达29%。心力衰竭主要是由于心脏的泵血功能不足以满足全身的供血需求引起的，这一点可能是疾病所致的心脏收缩功能的变化引起的，因此测量心肌细胞的收缩力和杨氏模量就可以定量的探究心力衰竭的原理及心力衰竭细胞的分子改变。Azeloglu和Costa用一种新型AFM压痕技术来测量新生大鼠自然搏动状态下的心肌细胞的硬度，结果显示心肌的弹性模量在收缩值（26.2±5.1）kPa和舒张值（7.8±4.1）kPa之间循环，且探针沿着细胞轴线探测到，心脏收缩硬度的空间异质性与肌纤维下面的肌小结的结构有关。Lieber S C等测量不同年龄的大鼠心肌的杨氏模量，4个月大鼠心肌的弹性模量（35.1±0.7，n=53）较30个月大鼠心肌的弹性模量（42.5±1.0 kPa，n=58）小，说明在单个老化心肌的弹性模量有显著增加，验证了心肌机械性能随年龄增长降低这一假说，在这之前随年龄增长心室肌硬度的变化在业内一直争议不休。

心肌梗死后心室重构是由于大量胞外基质在心肌局部心肌缺血坏死区沉积并纤维化引起的。功能性组织的损失和心肌弹性及收缩性的减低导致了机械低效的恶性循环，引起负面重构，影响舒张，最终造成心力衰竭。William Hiesinger等将基质细胞衍生因子（SDF）运送到缺血心肌，发现缺血心肌的微血管灌流明显增加并且维持了心室的几何形状和功能。他们认为这种可以增加微血管血液循环的基质细胞衍生因子（SDF）疗法可以拯救梗死边缘组织，从而提高心肌弹性，最终达到改善机械效率、维持心室几何形状的目的。Berry M F将注射了人间质干细胞的大鼠的冠状动脉结扎，建立心肌梗死模型。2周后测量杨氏模量，发现实验组心肌梗死区心肌细胞的杨氏模量是对照组小鼠心肌细胞杨氏模量的3倍。c11，c13，c33，c44，c66这五个刚性系数是用来描述表征单向排列的强化的纤维软组织的弹性线性性能的。Hoffmeister等人通过测量甲醛溶液固定的牛跟腱细胞和甲醛溶液固定的人心肌细胞的杨氏模量来分析这五个刚度系数。基于这些心肌的单向标本的杨氏模量的角关系引入模型来估测左心室壁更加复杂的纤维结构的特征。薄帽纤维粥样斑块（TCFAs）的断裂加之随后的血栓形成是心肌梗死的主要原因。TCFAs包括两部分：大的软脂块和其上覆盖的薄的坚硬纤维帽。Baldewsing等人为了观察动脉硬化并量化血小板应变药物疗法定量分析这两部分的形态和硬度，基于杨氏模量重建法，从血管内超声测量出的血小板应变弹性图中重建出了血小板的杨氏模量图。Chiaramida等人将有限元和循环模型应用于评价不同大小和位置的梗阻对血流动力学的影响，建立这个模型可以将局部的心肌损伤与整体血流动力学相结合。他们将左心室有限元充分整合到循环系统的电子模拟模型中，进而使整个左心室的收缩和左心室局部室壁运动异常与血流动力学结合分析。通过测量心肌杨氏模量随时间变化的曲线图得到血流动力学的变化。左心室压力容积关系受心室最初容积、几何形状和室壁厚度的共同调配。其中，同一生物体的室壁厚度是固定值，用杨氏模量来评价。Forrester等人测量正常犬和心肌梗死后犬心肌的杨氏模量，发现实验组的杨氏模量比对照组降低了41%。尽管由于心肌梗死，左心室壁的厚度之后会增加，但该实验证明心肌梗死后1h内室壁厚度就会减小，提示测量杨氏模量较仅用压力容积曲线更加敏感、准确。

四、前景展望

综上所述，用AFM测量细胞的杨氏模量获取细胞弹性及超微结构信息已成为全球细胞分子生物学研究的最热门的焦点之一。研究者越来越关注细胞的分子生物水平的性质，从分子生物的角度探索细胞的生理病理性质，更好地研究疾病的病因和生理改变，并进一步研究诊断治疗手段。由于AFM拥有纳米级分辨率，且具有测量活体细胞的动态参数等优势，细胞杨氏模量研究具有很广阔的前景。心肌梗死、心力衰竭及心肌肥厚等心脏疾病发生时，病变区域心肌的弹性会发生显著的改变，研究心肌细胞的杨氏模量可从微观角度观测疾病的发生、发展状况，进而对日益增长的心脏疾病的发病率起到控制的作用。未来的发展中，可以将测量仪器AFM进一步改良。例如，与超声仪器结合，真正实现三维动态观测活体细胞。另外，在研究中在测量心肌细胞的杨氏模量的同时观测心肌细胞的电生理及形态变化，多角度、全方位研究病变的生理病理改变。总之，细胞杨氏模量的研究前景很广阔，更值得学者们去深究，探索更多机体的奥秘。

（朱　烨）

参考文献

1　Gaboriaud E，Dufrene Y F.Atomic force microscopy of microbial cells：application to nanomechanical properties，surface forces and molecular recognition forces.Colloids Surf B：Biointerfaces，2007，54：10～19

2　Cross S E，Jin Y S，Rao J Y，et al.Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.Nat Nanotechnol，2007，2（12）：780～783

3　Lam W A，Rosenbluth M J，Fletcher D A.Chemotherapy exposure increase leukemia cell stiffness.Blood，2007，109（8）：3505～3508

4　Steinhauser E，Diehl P，Hadaller M，et al.Biomechanical investigation of the effect of high hydrostatic pressure treatment on the mechanical properties of human bone.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2006，Jan；76（1）：130～135

5　Abu-Lail N I，Camesano T A.The effect of solvent polarity on the molecular surface properties and adhesion of Escherichia coli.Colloids Surf B：Biointerfaces，2006，51：62～70

6　Venugopal，Jayarama Reddy，Prabhakaran.Biomaterial strategies for alleviation of

myocardial infarction.J R Soc Interface，2012，9（66）：1～19

7　Dynamic AFM elastography reveals phase dependent mechanical heterogeneity of beating cardiac myocytes.Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc，2009.2009，7：180～183

8　Hiesinger W，Brukman M J，McCormick R C，et，al.Myocardial tissue elastic properties determined by atomic force microscopy following SDF-1α angiogenic therapy for acute myocardial infarction.J Thorac Cardiovasc Surg，2012，3（4）：962～966

9　Berry M F，Engler A J，Woo Y J，et al.Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance.American Journal of Physiology，2006，290（6）：H2196～H2203

10　Baldewsing R A，Mastik F，Schaar J A，et al.Young’s modulus reconstruction of vulnerable atherosclerotic plaque components using deformable curves.Ultrasound Med Biol，2006，2（2）：201～210