低频超声对细胞凋亡的作用

第二节　低频超声对细胞凋亡的作用

超声造影剂微泡在低频超声作用下有可能空化产生高速微射流和冲击波，可以传递基因药物给细胞、栓塞肿瘤血管、溶解血栓，更有可能诱导细胞凋亡。因此，在心血管介入手术后平滑肌增生导致的血管再狭窄方面有应用前景。

在超声联合造影剂作用时，如果参数选择不当可能会引起细胞的即刻死亡，进而可能引起血管运动失调和炎症反应，导致血栓形成，刺激细胞再次增生。因此，对不同参数的超声场和造影剂联合作用下细胞凋亡和死亡的情况应作严格、深入的研究。已有对40多组平滑肌细胞采用不同浓度的造影剂微泡、在不同低频超声作用时间下进行了实验的研究。在70ml细胞培养盒的内底面上培养大鼠主动脉平滑肌细胞A7r5附壁生长满后，注入SonoVue造影剂后密封，放在超声处理槽内竖向波腹处经10s或20s的超声辐照后，用台盼蓝染色观测细胞即刻生存率在20%～99%，流式细胞仪采样测量辐照24h和72h细胞凋亡率为3%～30%。

实验发现，仅用低频超声时，超声的机械作用会使少量附壁细胞从壁面脱落，台盼蓝染色后显示，细胞病死率非常低，仅为4%左右；而在低频超声联合造影剂微泡作用后，大量细胞从壁面脱落，脱落区域呈圆形或椭圆形不均匀分布，多数细胞的胞膜变薄且不完整。提示胞膜通透性增加，线粒体有可能受损引发细胞凋亡，另有部分细胞受损死亡；而不同浓度的造影剂微泡联合不同作用时间的超声，细胞凋亡率为10%～33%。

有关超声诱导细胞凋亡的报道很多，但以往报道的剂量都偏大，Vykhodtseva报道用超声波（频率1.7MHz，声强70W/cm，辐照时间30s）辐照兔大脑组织，辐照后4h有9%±7%的脑细胞发生凋亡，48h后凋亡数量达到17%±9%。用测温仪同时测定辐照部位的温度变化情况发现，组织温度升高达43℃，认为与超声的热效应有关。Fitzgerald曾报道在猪支架植入术后内膜增生模型中，超声治疗组给予5min，700kHz的超声辐照后7d，使用Brdu掺入法检测辐照对血管平滑肌细胞，S期DNA复制的影响与对照组相比%Brdu显著降低（24.1%±7.0%vs.31.2%±3.0%，P<0.05），28d观察为36%±24%vs.44%±27%，P<0.05。Lawrie等用时差显微录像（高倍视野/2.4min摄像48h）观察超声辐照后3h起血管平滑肌细胞有丝分裂情况，发现辐照组（0.4W/cm²，1MHz，60s）较对照组和热处理组有丝分裂减弱。另有低强度超声辐照诱导白血病细胞系（K562，HL-60，G1a，and Nalm-6）凋亡的报道，该实验使用的超声剂量较前更低，为1.7MHz，7mW/ml，20s，不足以产生空化和热效应；但目前使用数十千赫的低频超声对动脉平滑肌的作用报道较少。

通常，超声治疗使用的频率往往为几十至几百千赫。流体中的超声波本身就是一种胀缩波。超声波引起的声场中介质的压缩和伸张，即为超声的机械效应。声频率较高时，正负压变化很快，细胞还未感觉到压缩期的压力时，声场已经转换为负压了。而低频时，声压变化比较慢，声场中的细胞受到正压或负压的时间较长。所以在不使用微泡的情况下，单纯使用超声干预时，应该是低频超声对细胞的作用的机械效应更明显。而且如果液体中所含有的气泡较少，这时超声对细胞的影响主要是通过机械效应来实现。

在既往的很多实验中，使用的多为高机械指数的超声干预平滑肌细胞，声强高，对组织的损伤性大。而且由于介质的吸收及内摩擦的损耗，一定时间内的超声连续作用可使介质中声场区域产生温升，难以判断超声对细胞的影响是由于机械效应还是热效应。由于单位时间内由于声吸收引起介质的温升与声频率的平方大致成正比关系，低频声场中更不易出现组织温度的升高。张波等发现在低频超声辐照（输出电功率135W，声压100kPa，声强1W/cm²）50s内，细胞并未出现明显的即刻死亡，但24h细胞凋亡率随超声辐照时间的延长而增加。这说明，在50s以内，超声并未使细胞发生即刻大量的坏死，但给细胞下达了凋亡的自杀信号，而且有其强度随超声辐照剂量增大而增大的趋势。