实验一 免疫血清的制备
实验目的
掌握免疫血清制备的原理和主要方法。
实验原理
按照一定的免疫程序，可诱导抗原免疫动物机体产生免疫应答，B淋巴细胞分化增殖形成浆细胞，并分泌抗原特异性抗体。由于抗体主要存在于血清中，因而从免疫动物获得的血清称为免疫血清或抗血清。在免疫血清的制备过程中，由于抗原分子具有多种抗原决定簇，可分别激活具有不同抗原识别受体的B淋巴细胞产生抗体，故此类免疫血清是针对多种抗原决定簇的多克隆抗体。要获得高效价的免疫血清除需要纯化抗原、使用佐剂外，还需要选择合适的动物及合理的免疫方案。
实验材料
（1）家兔（2～3kg，健康、无感染性疾患）。
（2）含纯化抗原的PBS溶液。
（3）不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂。
（4）5mL试管、注射器、100mm玻璃平皿、离心管、无菌烧瓶。
（5）家兔固定台、固定装置、手术器械。
实验方法
（1）血清的采集 取家兔，静脉采血，血样置于室温约1h后，经4℃过夜使血清析出，取上清液，于4℃下2 000r/min离心10min，吸取上清液作为未免疫的对照血清，于－20℃保存待测。
（2）抗原的乳化 用注射器吸取2mL含0．25～0．5g/L纯化抗原的PBS溶液，另一注射器吸取等量的完全弗氏佐剂，两个注射器之间用塑料管连接，来回反复抽吸，直至形成完全乳化的乳状液。判定完全乳化的方法：取一小滴乳状液，使其落到冷水表面，如果乳状液呈团状漂浮在冷水上且不分散，则表明已完全乳化。如果液滴分散，则需继续混合直至完全乳化。
（3）免疫动物 将家兔固定，分别经肌肉、皮内或皮下多部位给动物注射抗原乳状液，每部位注射0．1mL。每隔2～3周进行加强免疫，按照步骤（1）、（2）制备抗原，用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂作为免疫佐剂（免疫方法同初次免疫）。
（4）抗体效价的检测 在第2次加强免疫后2周，从家兔耳缘静脉采血1mL，按步骤（1）分离血清，采用双向琼脂扩散法（见第三章第三节）检测血清抗体效价，当抗体效价达到预期水平时，可于家兔禁食1d后收集免疫血清。若效价未达到实验要求，则需再进行加强免疫。
（5）免疫血清的收集 为防止乳糜血的形成，将家兔禁食1d后采血。采血方法常用的有心脏采血、颈动脉放血和耳缘静脉或耳动脉采血。
①心脏采血。将家兔仰卧固定于兔台，用左手触及心脏搏动最强的部位（在胸骨左侧，由下向上数第3肋骨与第4肋骨之间）。剪去左胸部的毛发，用碘酒消毒皮肤后，以注射器针头在预定位置与胸部呈45°角刺入心脏，微微上下移动针头，待血液进入针筒后，即将注射器位置固定，抽取血液至无菌烧瓶中。
②颈动脉放血。将家兔仰卧固定于兔台，使其头部略低以充分暴露颈部。剪去颈部毛发，用碘酒消毒皮肤。沿颈部正中线从下颌到胸骨柄切开长约10cm的皮肤，剥离皮下组织，露出肌层，用刀柄加以分离，暴露颈总动脉。选择血管中段，远心端用丝线结扎，近心端用血管钳夹住，将后接塑料放血管的注射针头插入颈动脉，并用丝线扎紧固定，松开止血钳放血。
③耳缘静脉或耳动脉采血。先将耳缘静脉附近的毛剪去，用无菌棉球将皮肤擦干净（不用75%乙醇消毒，避免溶血）。用台灯照射耳部，使局部血管因温度增高而扩张，用手拉住并固定兔耳，以手术刀片快速切开耳缘静脉或耳动脉（第一次切口应从耳尖部开始，以后再切时，逐步向耳根方向移动），立即用无菌试管或平皿收集血液，也可用注射器从耳缘静脉或耳动脉抽血。取血后用无菌棉球压迫切口止血。
④无菌条件下分离血清。将装有血液的玻璃平皿或烧瓶置于室温1h左右，待血液凝固后置于4℃过夜，使血清充分析出。将血清移入离心管中，2 000r/min离心10min。收集血清，分装储存于－40℃以下，或冻干后保存于4℃。使用前必须经过鉴定，合格后再分装保存备用。
实验结果
按照一定的免疫程序，抗原可诱导机体产生并分泌抗原特异性抗体，其双向琼脂扩散效价大于1∶32或ELISA效价大于1∶1 000。
注意事项
（1）免疫用动物的免疫反应存在较大的个体差异，所以制备免疫血清时不能只免疫一只动物，一般免疫3～4只。此外，不能使用妊娠期的动物进行免疫注射。
（2）要制备高效价的抗体，必须要加佐剂（一般采用完全弗氏佐剂）。但也应考虑到，如果抗原中有微量的杂蛋白存在，也可能因为有佐剂而产生非特异性的抗体，所以要根据实验需要和抗原的纯度适当地使用佐剂，同时，为制备特异性高的免疫血清，在纯化抗原过程中应尽量除去可能存在的杂蛋白，所用抗原纯度越高越好。
（3）免疫所用抗原必须完全乳化后才有免疫效果。
（4）免疫部位至少应有10个以上。
（5）通常经初次免疫和第2次加强免疫后，抗体效价可达到预期水平，如经检测未达到预期效价，需再进行加强免疫（直至双向琼脂扩散效价大于1∶32或ELISA效价大于1∶1 000）。
思考题
（1）抗血清制备过程中应注意哪些问题？
（2）如何提高免疫血清的效价、特异性？
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