免疫血清的鉴定和保存

实验二　免疫血清的鉴定和保存

实验方法

一、免疫血清的鉴定

分离的免疫血清必须经过质量鉴定，包括免疫血清抗体效价、特异性和亲和力测定。

1．免疫血清抗体效价的测定

免疫血清抗体效价的测定方法有很多，常用的方法有环状沉淀实验、双向琼脂扩散实验、酶联免疫吸附测定（ELISA）等。然而，各实验室更多的是根据实际用途采用相应的方法，如蛋白免疫印迹、免疫组化、流式细胞术等方法直接测定。

（1）双向琼脂扩散实验　它是免疫血清制备中最常用的鉴定方法，其具体方法是，在琼脂板中间孔加入10μL抗原（1g/L），周围孔依顺时针方向，分别加入用生理盐水或PBS溶液按1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64的比例稀释的动物免疫血清。经37℃保温24h后观察结果，效价在1∶32以上即可决定采血。

（2）ELISA　用纯化抗原包被96孔板，加系列稀释的免疫血清，洗涤后再加酶标记的抗兔抗体（酶标二抗），最后加底物显色，显色后用酶标仪检测。

（3）环状沉淀实验　它是较为经典的方法，方便快捷，但目前已较少采用。将一定浓度的抗原200μL加入到环状沉淀管中，然后在抗原液面上加入稀释的免疫血清，如在30 min内抗原与血清的交界面能出现“＋＋”的沉淀环，即为阳性反应。如测定抗体效价在1∶5 000以上时为合格。

2．免疫血清特异性的测定

抗体的特异性通常以交叉反应率来表示。可采用ELISA、放射免疫法等，以不同浓度的抗原与近似抗原的物质分别作竞争抑制曲线，计算各自的结合率，求出各自在IC₅₀时的浓度，按公式S＝Y/Z×100%计算交叉反应率。式中，S为交叉反应率，Y为IC₅₀时抗原浓度，Z为IC₅₀时近似抗原物质的浓度。特异性好的抗原免疫血清交叉反应率低，反之亦然。

3．免疫血清亲和力测定

抗体亲和力是指抗体与相应抗原结合的紧密程度，是评价抗体性质的最重要的指标之一。亲和力的高低一般以结合常数（Ka）或解离常数（Kd）表示，Ka的单位是L/mol，Kd的单位是mol/L，两者互为倒数。Ka值越大，表示抗体的亲和力越高；相反，Kd值越大，则表示抗体的亲和力越低。放射免疫法是经典的测定方法，但ELISA法更加简单方便，无放射污染，且灵敏度较高，是目前较为常用的检测方法。

二、免疫血清的保存

（1）经鉴定合格的免疫血清，以1∶100比例加入1%的硫柳汞或5%的叠氮钠，使其终浓度分别为0．01%或0．05%。

（2）用无菌滴管将抗血清分装小管，每管装1mL左右。

（3）－20℃以下保存，可保存2年以上。

（4）如有条件可将血清冷冻干燥保存于4℃以下，保存时间更久。

实验结果

收获的免疫血清应是无菌、无溶血的，具有较高效价（双向琼脂扩散效价大于1∶32或ELISA效价大于1∶1 000）、特异性和亲和力的多克隆抗体。

注意事项

（1）分离免疫血清所用的器皿要清洁干燥，以免发生溶血。

（2）分装保存的免疫血清应注明抗原的名称、免疫血清的效价、制备日期以及包装量。

（3）免疫血清应少量分装，于－20℃或－70℃处保存，避免反复冻融而导致效价降低。

思考题

（1）如何鉴定免疫血清？

（2）分离、储存免疫血清时应注意些什么？