通过杂交瘤细胞培养出抗体的用途

实验三　单克隆抗体的制备

实验目的

掌握单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）的制备原理及制备技术。

实验原理

B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化增殖形成具有针对该抗原特定表位分泌特异性抗体的能力，但是B淋巴细胞不可能持续分化增殖下去。将B淋巴细胞通过细胞杂交技术与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，这种克隆化的杂交瘤细胞既具有瘤的无限增殖的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力。用HAT选择性培养基筛选出融合的杂交瘤细胞，经反复克隆化，获取产生单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内，即可获得大量的高效价、抗单一抗原表位的特异性单克隆抗体。

实验材料

（1）实验动物：BALB/c健康小鼠，6～8周龄。

（2）抗原：依照实验需要选用相应的颗粒性抗原（细胞）或可溶性抗原（蛋白质或多肽）。

（3）骨髓瘤细胞：SP2/0细胞。

（4）RPMI 1640培养液、小牛血清、HAT培养液、HT培养液、PBS溶液、青霉素、链霉素、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、DMSO、石蜡油、PEG－400、台盼蓝、乙醇。

（5）剪刀、镊子、注射器、烧杯、细胞培养板、培养瓶、无菌离心管、冻存管。

（6）CO₂培养箱、超净工作台、倒置显微镜、离心机、液氮罐及液氮、水浴箱等。

实验方法

单克隆抗体的制备是一个复杂、精细的工艺过程，包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤与检查抗体、杂交瘤细胞的克隆化以及单克隆抗体的大量产生，通常要经过几个月时间完成一系列的实验步骤，下面按照单克隆抗体的制备流程进行介绍。

1．动物免疫

免疫方案与实验一免疫血清的制备的方案基本相同。

（1）准备1～50μg蛋白质或多肽抗原或（2～5）×10¹⁰个/L细胞抗原。

（2）蛋白质或多肽抗原需加完全弗氏佐剂并经充分乳化。细胞抗原在接种前加PBS洗3遍，配制成（2～5）×10¹⁰个/L细胞悬液，可不加佐剂直接进行免疫，就可得到较好的免疫效果。

（3）将乳状液或细胞悬液按照免疫方案进行免疫接种。可溶性抗原通常采用多点皮下接种，每点0．1mL，每只小鼠0．8～1mL。细胞抗原采用腹腔免疫，每只小鼠接种（1～2）×10⁷个细胞，共0．5～0．8mL。

（4）免疫后2～3周，用与初次免疫剂量相同的可溶性抗原加不完全弗氏佐剂制成乳状液，经皮下第2次免疫动物。或用与初次免疫相同的细胞量，经腹腔加强免疫。

（5）如需要，可于第2次免疫后7～10d取少量血清测定抗体效价。根据效价测定结果，决定是否需要进行加强免疫。

（6）最后一次加强免疫后，在细胞融合实验前三天再次加强免疫。可溶性抗原不加佐剂，直接用50～100μg的抗原溶液静脉注射，或用同上量的细胞进行腹腔注射或静脉注射。

为避免小鼠免疫反应不佳或免疫过程中死亡，可同时免疫3～4只小鼠。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异性抗体的可能性越大。

2．细胞融合

（1）骨髓瘤细胞的制备。

①骨髓瘤细胞的选择：为获取较高的杂交融合率，骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系。目前可用于单克隆抗体的制备的骨髓瘤细胞有多种，如NS1、SP2/0、X63 Ag8．653等，其中以不分泌Ig的SP2/0细胞系等较为常用。

②细胞培养：骨髓瘤细胞的培养适合使用一般的培养液，如RPMI 1640、DMEM等培养基，含10%的小牛血清。取1×10⁷～5×10⁸个/L SP2/0细胞，用RPMI 1640培养液培养，每两天换液1次，3～5d传代1次（1∶10稀释传代），待细胞生长至对数生长期时用于融合。

③骨髓瘤细胞悬液的制备：融合前一天换液1次，次日取轻度贴壁生长的SP2/0细胞，用无血清的RPMI 1640培养液洗涤3次，800r/min离心10min，用5mL RPMI 1640培养液重悬细胞，计数后，调整为1×10¹⁰个/L的细胞悬液备用。

（2）饲养细胞的制备：饲养细胞一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。

①选择与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/c小鼠，6～10周龄。

②颈椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇溶液浸泡消毒10min。

③用手术剪将小鼠腹部剪开一个小口，剥开皮肤，露出腹膜。用无菌注射器注入5～6mL预冷的1640培养液至腹腔，仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

④1 000r/min离心10min，弃上清液。用HAT选择培养液重悬沉淀细胞，调整细胞数至2×10⁸个/L。

⑤加入96孔板，100μL/孔，置于37℃的CO₂培养箱，即可供细胞融合和克隆化之用。接种2～4块培养板。

（3）脾脏细胞的制备。

①小鼠经末次加强免疫3d后，用颈椎脱位法处死小鼠，浸泡于75%乙醇溶液中。无菌条件下取脾脏，操作过程为：在超净台内将小鼠取右侧卧，用经灭菌处理的剪刀剪开颈部皮肤，然后用镊子将皮肤撕至尾部，充分暴露左侧背部，用酒精棉球消毒后，剪开左侧背部肌肉，暴露条状脾脏。剥离后用镊子取出脾脏放入平皿中，用RPMI 1640培养液洗涤。

②取一无菌平皿，将200目铜网或不锈钢筛网置入平皿内，加入一定量的培养液，用注射器内塞充分研碎脾脏，获得脾脏细胞悬液。用注射器将脾脏细胞悬液吸入预冷的离心管中，4℃，1200r/min离心10min，弃上清液。

③加入Tris－NH₄Cl裂解红细胞，4℃，1200r/min离心10min，弃上清液。

④用培养液洗涤所收集的细胞3次。

⑤加入2mL培养液，重悬收集的细胞。台盼蓝染色计算活细胞数，以高于80%为合格。用计数板计数细胞，调整成浓度为1×10¹¹个/L的脾脏淋巴细胞悬液备用。

（4）细胞融合：细胞融合的有多种方法，如物理融合、化学融合和生物融合等，其中以化学融合中的聚乙二醇（PEG）为融合剂的方法最为常用。

①将骨髓瘤细胞与脾脏细胞按1∶10或1∶5的比例混合于50mL离心管，用无血清不完全培养液洗1次，1200r/min离心8min。弃上清液，尽量吸净残留液体，轻弹离心管管底，使细胞沉淀略松动。

②于1min内加入37℃预温的50%PEG溶液1mL，边加边轻微摇动离心管。于37℃水浴作用1min。

③加37℃预温的不完全培养液以终止50%PEG溶液的作用：1min内匀速滴加1 mL，后每隔1min分别加入2mL、3mL、4mL、5mL和6mL，边加边轻微摇动离心管。

④800r/min离心5min，弃上清液，轻弹离心管管底，使细胞沉淀略松动，用HAT选择培养液重悬细胞，制备成浓度为2．5×10⁹个/L的细胞悬液。

⑤将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μL。

⑥将培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

3．杂交瘤细胞的选择与抗体的检测

在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而脾脏淋巴细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞具有上述两种酶，故可在HAT选择培养液中生长繁殖。

（1）在融合后1～2d将有大量的瘤细胞死亡，3～4d后瘤细胞基本消失，杂交瘤形成小集落。在培养的1、2、3、5d换1/2体积的新鲜HAT培养液，换液时注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

（2）第7天同上法加入含有HT的培养液，2～3d半量更换培养液，再持续培养2周。后续换液则用不含HAT或HT的完全培养液。每次换液前用倒置显微镜观察细胞的生长情况。

（3）当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时（10～12d），即可吸取上清液，开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。但也有在1个月左右才出现特异性抗体的。

（4）对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消选择培养液，改用完全RPMI 1640培养液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

（5）抗体的检测。检测抗体特异性分泌的方法很多，一般以快速、简便、特异和敏感为原则，根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法。最常用的方法有：酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定、免疫荧光检测等，其中以ELISA最为常用（具体操作参见相关章节）。

4．杂交瘤细胞的克隆化

经过HAT筛选后，并非一个孔内可能只有一个克隆，有的孔可能有数个甚至更多的克隆，其中包括抗体分泌细胞和抗体非分泌细胞。杂交瘤克隆化是将经检验抗体阳性孔的细胞进行克隆化，以获取真正的单克隆抗体分泌细胞。杂交瘤细胞克隆化的方法有多种，如有限稀释法和软琼脂平板法等，其中以有限稀释法最为常用。

（1）克隆前一天制备饲养细胞层（方法同前）。

（2）筛选取出阳性孔内的细胞，计数，并用台盼蓝染色计算出活细胞的比例，调整细胞浓度为5×10³～1×10⁵个/L。

（3）取前一天准备的含有饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μL。于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育。

（4）在第7天换液，以后每2～3天换液1次。

（5）第8～9天时可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。

（6）将抗体阳性且为单克隆生长的细胞进行再次克隆化（重复上述克隆化步骤）。

（7）将阳性细胞移至24孔板中扩大培养，并尽快冻存每个克隆的细胞。

5．单克隆抗体的大量制备

单克隆抗体的大量制备主要方法有体外大量培养杂交瘤细胞和体内接种杂交瘤细胞。

体外制备方法是将杂交瘤细胞用无血清培养液体外培养，从细胞培养上清液中获取单克隆抗体，但此方法产量低（一般培养液内抗体含量为10～60mg/L）且费用较高。

体内制备方法是将杂交瘤接种于同系小鼠腹腔，制备腹水或血清。此法可获高浓度的单克隆抗体（腹水中抗体浓度可达5～10g/L），且成本较低，目前较为常用，具体方法如下。

（1）预先注射0．5mL降植烷或石蜡油至小鼠腹腔内。

（2）1～2周后，取对数生长期的杂交瘤细胞，用PBS溶液洗涤3次，1 000r/min离心10min，PBS溶液重悬细胞，调整细胞浓度为（1～2）×10⁹个/L，注射1mL细胞悬液至小鼠腹腔内。

（3）7～10d后可产生腹水。密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多时，用注射器刺入腹腔，视腹水多少抽吸3～5mL，2000r/min离心10min，吸取上清液，分装后冻存。2～3d后，小鼠继续长出腹水，可按上述方法再次进行腹水收集，直至不长腹水（不超过1周）。

6．单克隆抗体的鉴定

单克隆抗体的鉴定通常进行其效价、特异性、Ig类与亚类、亲和力等方面的鉴定（参见免疫血清的鉴定相关内容）。

实验结果

（1）在小鼠免疫血清中检测出高效价、高亲和力的特异性抗体。

（2）细胞融合实验完成后，在显微镜下观察到培养孔有融合和（或）未融合的细胞。

（3）初步筛选时，在显微镜下观察有单一簇紧密生长的细胞或几簇细胞融合生长的杂交瘤。

（4）经反复克隆化，可有效筛选获得能稳定增殖和分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。

注意事项

（1）在细胞培养过程中，注意无菌操作，防止污染的发生。

（2）除RPMI 1640培养基外，DMEM培养液常用于骨髓瘤细胞的培养，每3～5天传代一次。

（3）在制备McAb的过程中（如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中），加入饲养细胞是十分必要的。小鼠腹腔巨噬细胞为较为常见的饲养细胞。

（4）采用体内制备方法大量制备单克隆抗体时，接种的动物一般应选择与杂交瘤同系的动物。

（5）细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8－氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一敏感性。

（6）筛选出的阳性杂交瘤细胞株应及时保存，备用。

思考题

（1）简述单克隆抗体制备技术的基本原理及基本过程。

（2）单克隆抗体鉴定的指标主要有哪些？

（徐　琦）

参考文献

［1］周光炎．免疫学原理［M］．上海：上海科学技术文献出版社，2001．

［2］刘辉．临床免疫学与检验实验指导［M］．北京：人民卫生出版社，1999．

［3］金伯泉．医学免疫学［M］．5版．北京：人民卫生出版社，2008．