细菌的试管凝集实验

实验三　细菌的试管凝集实验

不同稀释度抗体与抗原在试管内结合并出现凝集的现象，称为试管凝集实验。即对抗体进行连续稀释后，加入某种抗原，观察凝集现象，进而判定有无相应抗体及其相对含量，是一种半定量检测方法。该方法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的辅助诊断。

实验目的

（1）掌握试管凝集实验的原理及操作方法，并正确判定实验结果。

（2）理解血清凝集效价的含义。

实验原理

用已知颗粒性抗原检测未知抗体及其相对含量。方法是在试管内用生理盐水连续倍比稀释待检者血清后，各管加入等量已知抗原悬液，孵育后观察凝集现象。以发生明显凝集反应的实验管血清最高稀释度为该血清的凝集效价，判断实验结果。

实验材料

（1）伤寒沙门菌O菌液、H菌液。

（2）待检者血清，经56℃30min灭活。

（3）生理盐水、试管、试管架、吸管、恒温箱、记号笔等。

实验方法

（1）取洁净小试管20支，分两排置于试管架上，用记号笔标记管号。

（2）用刻度吸管吸取生理盐水，于每排第1管加入0．9mL，其余2～10号管均加入0．5mL。

（3）取待检者血清，于每排第1管加入0．1mL，并将管内液体吸吹3次，使血清与生理盐水充分混匀。然后吸取0．5mL液体至第2管，按照上面的方法混匀，再从2管吸取0．5mL至第3管，依次操作直至第9管，混匀后从第9管吸出0．5mL液体弃去。第10管不加血清，作为阴性对照。至此，1～9号试管血清稀释度依次为1∶10、1∶20、1∶40～1∶2560。

（4）向第一排管每管分别加入伤寒沙门菌O菌液0．5mL，第二排管每管分别加入伤寒沙门菌H菌液0．5mL。加菌液时从第10管加起，逐个向前加至第1管。此时，每支试管内液体总量为1mL，第1～9管的血清最终稀释度分别为1∶20、1∶40、1∶80～1∶5120。

（5）轻轻摇匀，置于37℃恒温箱内过夜，或56℃水浴2h后取出观察结果。

实验结果

（1）勿摇动试管架，以免将沉于试管底部的凝集块破坏。

（2）对照管不发生凝集，液体浑浊，细菌沉于试管底部，呈边缘整齐的圆点状，说明本次实验结果可信。

（3）观察1～9号管，先观察液体的浑浊度，再观察管底的凝集物（阳性管可见管底边缘不整齐的凝集物，O菌液形成的凝集物颗粒状，轻微振摇可悬浮起来，不易摇碎；H菌液形成的凝集物呈絮状，轻摇易碎）。凝集强度判定标准如下。

＋＋＋＋：细菌完全凝集，凝集块沉于管底，液体澄清；

＋＋＋：细菌大部分凝集，凝集块沉于管底，液体稍浑浊；

＋＋：细菌部分凝集，管底凝集物比前者的少，但仍明显，液体半澄清；

＋：凝集物极少，需仔细观察才能发现，液体浑浊；

－：同阴性对照管。

（4）判定血清凝集效价：取出“＋＋”凝集现象的最高血清稀释度作为该免疫血清的凝集效价。

注意事项

（1）取样、加样应准确。

（2）稀释血清时应仔细认真，不可漏管。

思考题

（1）玻片凝集实验与试管凝集实验有何不同？

（2）本实验为什么要稀释免疫血清？

（3）加伤寒沙门菌菌液时，为何不从第一管加起？