反向间接凝集法检测

实验五　反向间接凝集法检测AFP

间接凝集实验若以红细胞为载体，则称为间接血凝实验。它包括3种类型。①正向间接血凝实验：将已知可溶性抗原吸附在人或其他动物红细胞表面，然后与相应抗体结合产生的凝集现象，用于检测未知抗体。②反向间接血凝实验：将特异性抗体吸附于红细胞上，然后再与相应抗原结合产生凝集现象，用于检测未知抗原。③间接血凝抑制实验：在待检抗体样本中，先加入相应抗原，然后再加入吸附了同一抗原的红细胞，则不再发生凝集反应，为正向间接血凝抑制实验，反之若待检抗原与其相应抗体接触，也不再与同一抗体致敏的红细胞发生反应，称为反向间接血凝抑制实验。

本实验以应用反向间接血凝实验的原理检测甲胎蛋白（AFP），以掌握间接血凝实验的原理、操作方法等，临床上也常用此法普查肝癌患者。

实验目的

了解反向间接凝集实验的原理及临床应用。

实验原理

甲胎蛋白为分子量70 000D的糖蛋白，出现在胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常人血清AFP含量极微（低于25ng/mL），以常规方法检测不能检出。当肝细胞癌变时，AFP显著增高，睾丸、卵巢畸胎瘤及孕妇、急性肝炎患者血清中也可检出。

实验材料

（1）甲胎蛋白致敏的红细胞：吸附了抗AFP抗体的红细胞。

（2）待检血清、阴性对照血清、阳性对照血清、生理盐水。

（3）V形微量血凝板、试管、滴管。

实验方法

（1）将待检血清用生理盐水作1∶10、1∶100、1∶1 000稀释。

（2）将每个稀释度的血清及阳性、阴性对照血清以及生理盐水依次各加1滴于V形微量血凝板的各孔内。

（3）于各血清孔内分别滴加1滴甲胎蛋白致敏的红细胞。

（4）振荡血凝板，使内容物混匀，室温静置1h后观察反应结果。

实验结果

先观察阳性对照，应该有凝集现象，阴性对照、生理盐水对照应该无凝集现象。以下列标准判断红细胞凝集的强弱。

＋＋＋＋：红细胞形成薄层凝集，布满整个孔底及周边，边缘有时可向内翻卷。

＋＋＋：红细胞形成薄层凝集，面积比“＋＋＋＋”的稍小，中心隐约可见少量未凝集的红细胞形成的小红点。

＋＋：红细胞形成薄层凝集，面积较小，中心可见沉积的红细胞形成疏松的红点。

＋：红细胞在孔底形成致密红色圆点，周围可见少量凝集的红细胞。

－：红细胞无凝集，全部自然下沉于孔底，形成致密小红点，边缘整齐光滑。

若某一血清稀释度阳性，则应继续稀释该血清（若1∶10阳性，1∶100阳性，1∶1 000阴性，则进行1∶100、1∶200、1∶1400、1∶600等稀释），以出现“＋＋”血凝现象的血清最高稀释度为该血清的阳性终点效价。

注意事项

（1）待检血清中不能含有待检者的红细胞。

（2）若用动物红细胞进行实验，应注意待检者血清中可能含有针对动物红细胞表面抗原的抗体。

思考题

（1）何谓正向、反向间接血凝实验？

（2）本实验中，AFP阳性的标本是否一定来自肝癌患者？