单向琼脂扩散实验

实验八　单向琼脂扩散实验

实验目的

掌握单向琼脂扩散实验的原理、方法、结果分析和临床用途（以检测血清IgG含量为例）。

实验原理

将适当浓度的抗体混匀于琼脂凝胶内，琼脂板上打孔，孔中加入抗原，抗原向四周扩散并与凝胶中抗体发生反应，抗原抗体在比例适宜处形成沉淀环。沉淀环直径大小与孔中抗原浓度呈正比，可由此绘制标准曲线，将待检抗原的沉淀环直径数值代入标准曲线即可确定待检抗原的量，这是一种定量实验。

实验材料

（1）待检患者血清1、2、3、4号。

（2）羊抗人IgG诊断血清（效价1∶60）、标准参考血清。

（3）15g/L的食盐琼脂、pH值为7．4的0．01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）、塑料反应板、湿盒、打孔器、微量移液器等。

实验方法

（1）将羊抗人IgG诊断血清与融化的琼脂以1∶60比例混匀后浇板，每板4～5mL左右，冷却凝固。

（2）用3mm打孔器在琼脂板上打孔，空间距为1．2～1．5cm，挑出孔内琼脂。

（3）将冻干免疫球蛋白参考血清1支，加入0．5mL蒸馏水溶解，用PBS溶液稀释成如下几种稀释度，分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL等。

（4）用微量移液器分别取各种不同稀释度的参考血清10μL加入琼脂板各孔内，将加样的琼脂板置于湿盒内，于37℃处反应24～48h，取出反应板，测量其沉淀环直径（如图3－1）。以浓度为横坐标，沉淀环直径为纵坐标绘制标准曲线。

图3－1　单向琼脂扩散实验参考血清结果示意图

（5）同时，取相同的琼脂板打孔，1∶50稀释的待检血清1、2、3、4号各10μL分别加入各孔，置于湿盒内，与上述相同条件下孵育后，观察结果。

实验结果

测量各待检血清与相应抗体形成的沉淀环直径（如图3－2），在标准曲线上可查知待测IgG的含量，乘以稀释倍数，即为待检患者的IgG含量。

图3－2　单向琼脂扩散实验待检血清结果示意图

注意事项

（1）浇板时抗体与琼脂要充分混合均匀，温度宜在50～56℃，琼脂板宜水平放置。

（2）每批实验应同步绘制标准曲线。

（3）加样时勿使液体外溢或产生气泡。

思考题

（1）为什么水浴温度要保持在50～56℃范围内，超出这一范围会有什么后果？

（2）单向琼脂扩散实验影响因素有哪些？有何实际应用？