沉淀反应琼脂扩散实验

实验九　双向琼脂扩散实验

实验目的

（1）掌握双向琼脂扩散实验的原理、方法、结果分析和临床用途。

（2）了解检测甲胎蛋白的临床意义。

实验原理

抗原与相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周扩散，在比例适宜处形成肉眼可见的白色沉淀线。根据沉淀线的位置、外形可以对抗原抗体进行分析，主要用于对抗原、抗体进行纯度鉴定、效价的滴定及临床疾病的检测等。

实验材料

（1）待检患者血清。

（2）阳性对照血清（含甲胎蛋白，AFP）、阴性对照血清（正常人血清），抗－AFP诊断血清。

（3）15g/L的盐水琼脂，微量移液器，反应板，打孔器，湿盒，恒温箱等。

实验方法

（1）吸取融化的15g/L的盐水琼脂4～5mL，浇注在塑料反应板上，琼脂厚度约2 mm，冷却凝固。

（2）用3mm打孔器打孔，孔间距5mm左右，如图3－3所示，挑出孔内琼脂。

图3－3　双向琼脂扩散凝胶打孔示意图

（3）以微量移液器吸取抗－AFP诊断血清10μL加入中央孔（A孔），a、d孔分别加入阳性对照血清10μL，f、b孔分别加入待检血清10μL，e、c孔分别加入阴性对照血清10μL。

（4）将琼脂板置于湿盒内，在37℃处孵育，分别于24h、48h、72h观察结果。

实验结果

待检血清孔与抗－AFP诊断血清孔（即中央孔）之间出现白色沉淀线，并与阳性对照血清的沉淀线发生融合者为阳性，若72h后仍未出现沉淀线或沉淀线与阳性对照血清沉淀线出现交叉者，均为阴性（图3－4）。

图3－4　双向琼脂扩散实验结果示意图

注意事项

（1）加样时勿使液体外溢或产生气泡，琼脂板宜水平放置。

（2）于37℃扩散后，置于冰箱内放置一定时间后观察，沉淀线更清晰。

思考题

（1）为什么要尽可能同时加入抗原和抗体？扩散过程中为何要保持环境潮湿？

（2）双向琼脂扩散实验的特点有哪些？