酶免疫组化测定－－

实验三　酶免疫组化技术：酶免疫组化测定EBV－VCA－IgA

免疫组化技术（immunohistochemistry technique）是应用标记的特异性抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对抗原进行定性、定量、定位检测。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞水平、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等），并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。免疫组化技术近年来得到迅速发展。20世纪50年代还仅限于免疫荧光技术，随后逐渐发展了更敏感且更为实用的免疫酶技术。常用的技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等。

酶免疫组化（enzyme immunohistochemistry technique）是以酶为标记物检查抗原在组织中的分布或组织抗原的抗体的一种技术。

实验目的

（1）掌握酶免疫组化测定EBV－VCA－IgA的实验原理。

（2）熟悉该实验的操作方法、应用及临床意义。

实验原理

用带EB病毒壳抗原（VCA）的类淋巴细胞作为抗原靶细胞，将可能含有相应抗体的系列血清与靶细胞一起孵育，洗去未结合的抗体和非特异性成分；再加入酶标记抗体（羊抗人IgA－HRP），孵育一定时间后，洗去过量的酶标抗体，即形成抗原靶细胞（VCA）_－IgA－酶标记抗IgA复合物，最后加入底物，结合上酶标抗体的靶细胞出现底物沉积而着色，即为阳性细胞。若病人血清中查出较高浓度的EBV－VCA－IgA抗体，对鼻咽癌的早期诊断和预后判定有重要的意义。

实验材料

（1）试剂盒：B95株靶细胞片、羊抗人IgA－HRP、3，3′－二氨基联苯胺、稀释液、底物缓冲液、阳性对照。

（2）0．01mol/L的pH值为7．4PBS，3%的H2O₂，2mol/L的H2SO₄。

（3）阴性对照血清，待检血清。

（4）湿盒、染色缸、毛细吸管、微量移液器、电吹风、显微镜、振荡器等。

实验方法

（1）从4℃冰箱中取出靶细胞片，室温吹干。

（2）用0．01mol/L的pH值为7．4PBS将待检血清作1∶5、1∶10、1∶20稀释，滴加于靶细胞片各孔内，最后3孔分别加EBV－VCA－IgA阴性、阳性对照血清和PBS（空白对照），所加液体不能溢出小孔。

（3）37℃孵育30min，用PBS轻洗3次（每次5min），最后一次洗后于室温晾干或用电吹风吹干。

（4）用0．5mL稀释液溶解酶标羊抗人IgA，滴加于各小孔内（约50μL），放入湿盒37℃孵育30min，洗涤3次。

（5）将4mg 3，3′－二氨基联苯胺充分溶于10mL底物缓冲液中，加入新配制的3%的H2O₂（底物溶液临用前配制）。滴加底物溶液（约50μL）于抗原片上，避光作用10min，使之显色。

（6）倒掉底物液，蒸馏水洗后吹干，用显微镜观察结果。

（7）若需长时间保存，可将细胞片取出后置于乙醇中浸泡3min脱水，再滴加中性树胶，加盖玻片封固。

实验结果

阴性：细胞不着色，或呈浅棕色的背景颜色。

阳性：细胞呈棕色，在细胞膜周围着色较深。

根据显色强度和阳性细胞的数量判定为“＋”～“＋＋＋＋”。

＋＋＋＋：在低倍镜下每视野有100个以上的阳性细胞，呈深棕色。

＋＋＋：在低倍镜下每视野有数十个阳性细胞，呈棕色。

＋＋：在低倍镜下每视野散布有少数阳性细胞，呈浅咖啡色。

＋：在若干低倍视野下可见少数阳性细胞，呈浅咖啡色。

注意事项

（1）试剂盒应于2～10℃冷藏保存，在有效期内使用。酶标抗体不可反复冻融。

（2）靶细胞片极易受潮或因存放不当而失去活性，故应密封干燥保存。

思考题

分析酶免疫组化测定EBV－VCA－IgA的临床应用价值。