实验四间接免疫荧光法检测抗核抗体（

实验四　间接免疫荧光法检测抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）

实验目的

（1）掌握间接免疫荧光法检测ANA的实验原理。

（2）熟悉其操作方法及应用。

实验原理

间接免疫荧光法（IIF）是利用荧光标记第二抗体检测未知抗原或抗体（第一抗体）的方法。IIF可作为总的ANA筛选实验。ANA是一组将自身真核细胞的各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称。ANA的免疫球蛋白类型主要是IgG，无器官和种属特异性。已有20余种ANA相继被发现，它主要存在于血清中。

IIF检测ANA是用小鼠的肝脏印片或肝匀浆涂片为抗原基质片，加入标本血清，标本中的抗核抗体（ANA）与抗原基质片中的细胞核抗原结合，结合的抗体再与荧光素标记抗人免疫球蛋白或IgG（荧光素标记的抗抗体）结合，经洗涤后在荧光显微镜下可见到发荧光的抗原抗体反应（细胞核抗原－ANA－荧光素标记的抗抗体），以此来检查标本中相应的ANA。

实验材料

（1）小鼠一只。

（2）FITC（异硫氰酸荧光素）标记羊抗人IgG（荧光素标记的抗抗体），0．01mol/L pH值为7．2的PBS，95%乙醇，瑞氏染色液，生理盐水。

（3）待测血清、阳性对照血清、阴性对照血清。

（4）荧光显微镜，37℃温箱，吹干机，立式染色缸，有盖湿盒，试管，吸管，玻片，蜡笔、镊子等。

实验方法

（1）鼠肝片的制备。

①采用颈椎脱臼法处死小白鼠，取其肝脏，用生理盐水洗去残血，用吸水纸吸干。

②印片：小镊子夹取肝脏，用剪刀将其在水平面上剪成小的肝片，将小的肝片印至玻片上，每片可印三个直径约0．5cm左右的薄膜（不宜过厚），立即吹干。

③固定：将上述鼠肝片放在95%乙醇中固定5min，吹干后密封于干燥容器中，放入冰箱中保存备用。

④瑞氏染色：取已固定的鼠肝片一张，瑞氏染色，观察印片的细胞核是否完整，如细胞核完整并被染成蓝色时，其余印片方可应用。

（2）抗核抗体检测。

①将待检血清置入56℃水浴灭活30min。

②取鼠肝片一张，将所印薄膜周围用蜡笔画一圆圈，印膜上滴加灭活的待检血清1滴，放进有盖湿盒中，平放于37℃温箱孵育30min。

③取出鼠肝片，略用自来水冲洗后，再置入0．01mol/L pH值为7．2的PBS中浸泡5min，共重复3次，吹干。

④印膜上滴加荧光素标记的抗人球蛋白抗体（按工作浓度稀释）1滴，置入37℃温箱中30min。

⑤取出鼠肝片，略用自来水冲洗后，再置入0．01mol/L、pH值为7．2的PBS中浸泡5min，共重复3次，吹干。

⑥放荧光显微镜下观察结果。

⑦每次实验均需作下列对照。

A．阳性血清对照：阳性血清＋荧光素标记的抗抗体；

B．阴性血清对照：阴性血清＋荧光素标记的抗抗体；

C．荧光抗体对照：PBS缓冲盐水＋荧光素标记的抗抗体。

⑧发现阳性者，可将标本作1∶2、1∶4、1∶8……稀释再检测，以此可以测定ANA的效价/滴度。

实验结果

（1）荧光抗体对核的染色，可由于核抗原和相应的抗核抗体的不同而观察到以下几种核荧光染色形态（荧光核型）。

①匀质型：由抗核蛋白抗体（抗DNP抗体）所产生的核染色，整个细胞核呈现均匀一致的荧光染色。

②核膜型：又称周边型，是由抗DNA抗体形成的核染色，表现为核周围的向外扩散呈绒毛状荧光染色，核区亮度较弱。

③斑点型：由抗可提取性核抗原抗体（抗ENA抗体）所产生的核染色，在核的中央部分染色较浓，可见颗粒状荧光斑点。

④核仁型：比较少见，是由抗核小体抗体所产生的染色，在核内可成点状荧光染色。

阴性标本仅可见深墨绿色的非特异的荧光背景，有时还可见到与核形态大小相仿的空隙状暗区。

（2）荧光强度分级。

“－”，无荧光；“±”，荧光微弱可见；“＋”，荧光可见；“＋＋＋”，荧光耀眼；“＋＋”，介于荧光可见与耀眼之间。

（3）效价。

以荧光强度为“＋＋”的最高稀释度为ANA的效价（或滴度）。

注意事项

（1）核抗原片不宜太厚，否则容易出现非特异性染色。

（2）荧光抗体切勿反复冻融。

（3）滴加的血清或荧光抗体，要充分覆盖核抗原片，孵育时不可流失，否则将出现假阴性。

（4）染色后应立即观察实验结果，否则荧光易猝灭。观察结果最好在暗室中进行，应注意与组织非特异荧光相鉴别，后者常大小不等、形态不一、边缘不整齐。

（5）结果观察时，先观察对照孔，特别是阴性对照应无非特异荧光。

（6）核抗原片除可用大（小）鼠肝细胞外，还可用外周血中性粒细胞（应注意可受血型和抗白细胞抗体的干扰）、Hep－2细胞和Hela细胞涂片。

思考题

（1）分析免疫荧光间接法与直接法的异同，比较哪种方法更有优势。

（2）简述IIF法检测ANA的临床意义，该方法能辅助诊断哪些疾病。