－密度梯度离心法分离人

实验一　Ficol－Hypaque密度梯度离心法分离人PBMC

实验目的

了解密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的原理；掌握Ficol－Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的操作过程。

实验原理

人外周血中包含了红细胞、粒细胞、淋巴细胞及单核细胞等多种细胞，通常将其中含有单一细胞核的单核细胞和淋巴细胞统称为外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。从外周血中分离PBMC是进一步分离、评估和研究免疫细胞功能的基础。外周血中各种细胞的比重不同，其中，淋巴细胞与单核细胞的比重约为1．070，而粒细胞和红细胞的比重约为1．092。因此，选择一种比重介于两类细胞之间的介质，将抗凝血加入到介质上，通过离心，即可使特定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，从而达到将PBMC与其他血细胞分离开的目的。目前，用于分离外周血PBMC的主要有Ficol－Hypaque和Percoll分离液等，以前者最常用。Ficol－Hypaque是由6%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。它的相分子质量大、无化学活性、20℃时比重为1．077±0．001，介于PBMC和红细胞之间。

实验材料

（1）Ficol－Hypaque分离液（比重1．077±0．001）。

（2）肝素。

（3）无Ca^2＋、Mg^2＋的Hanks溶液，pH值为7．2～7．6。

（4）RPMI－1640培养液（含10%的小牛血清）。

（5）其他：注射器、吸管、滴管（均为无菌），细胞计数板，水平离心机，显微镜等。

实验方法

（1）无菌抽取静脉血2mL，去掉针头注入含有肝素的无菌试管中并摇匀，加入2mL PH值为7．2的Hanks液进行对倍稀释，混匀。

（2）用吸管吸取稀释后的血液沿试管壁缓缓加到含有2mL淋巴细胞分离液的试管中（血液、Hanks液和淋巴细胞分离液的比例为1∶1∶1），使稀释血液缓慢逐层叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。

（3）离心：2000r/min离心20min，小心取出试管。

（4）用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次1 500r/min离心10min。

（5）弃上清液，加入RPMI－1640培养液1mL并混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。

①细胞计数：取1滴细胞悬液置细胞计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数后，按下列公式计算出细胞总数：

细胞总数＝四个大方格细胞总数/4×稀释倍数×细胞悬液毫升数×10⁴

②台盼蓝拒染法测定细胞活力：取4份0．2%的台盼蓝与1份4．25%的生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3min之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成蓝色为死细胞），计算活细胞占细胞总数的百分数。

细胞存活率＝活细胞数/（活细胞数＋死细胞数）×100%

（6）最后将淋巴细胞悬液用RPMI－1640培养液配成相应的细胞浓度，备用。

实验结果

离心20min后，细胞出现如下图所示的分层（图5－1）。在回收Ficol分离液上界面细胞层中，PBMC应占90%以上（细胞存活率高于90%），粒细胞少于5%，血小板少于0．5%，红细胞少于7%。

图5－1　外周血PBMC分离结果示意图

注意事项

（1）抽取的抗凝血应在2h内使用。

（2）注意将稀释的抗凝血沿管壁轻轻逐层铺在分离液液面上，切忌冲破分离液液面。

（3）在获取PBMC时，以吸管轻轻插入PBMC层，沿管壁轻轻旋转吸取细胞。

思考题

影响Ficol－Hypaque密度梯度离心法分离人PBMC的主要因素有哪些？