小鼠腹腔巨噬细胞的分离

实验四　小鼠腹腔巨噬细胞的分离

实验目的

掌握小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法。

实验原理

腹腔中含有大量的免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞等。腹腔也含有大量巨噬细胞的前体，因此是收集组织巨噬细胞前体的理想场所。利用4℃预冷的RPMI－1640培养液冲洗腹腔，可诱导腹腔巨噬细胞从组织中进入洗液；由于单核－巨噬细胞具有强烈黏附塑料器皿的特性，可将抽出腹腔的巨噬细胞置于冰上预冷的容器并用预冷PBS洗涤，防止细胞在操作过程中损耗；在获得腹腔细胞后，可利用贴壁法除去非贴壁细胞而富集巨噬细胞。如需要更多量的巨噬细胞，可通过预先向小鼠腹腔注射刺激剂降植烷或无菌石蜡油等诱导产生腹腔炎症，从而诱导大量巨噬细胞生成和渗出。

实验材料

（1）6～8周龄Balb/c或昆明种小鼠；

（2）RPMI－1640培养液；

（3）胎牛血清；

（4）PBS（无Ca^2＋/Mg^2＋）；

（5）0．4%台盼蓝染液；

（6）温控低速离心机；

（7）显微镜；

（8）细胞计数板、离心管、6孔塑料培养板、50mL塑料针筒、剪刀与镊子等。

实验方法

（1）颈椎脱臼法处死小鼠；

（2）70%乙醇浸泡10s；

（3）固定小鼠四肢，以眼科剪在右侧腹股沟区剪一小切口，由此切口撕裂皮肤暴露腹壁；

（4）70%乙醇冲洗腹壁；

（5）一手持镊子轻轻提起左侧腹壁，另一手以无菌注射器抽取4mL预冷至4℃的RPMI－1640培养液注入腹腔；

（6）轻轻按揉腹壁2min；

（7）用预冷的无菌吸管自右侧腹壁小切口吸取3～3．5mL腹腔液，加入10mL无菌试管中；

（8）1800r/min离心20min，去上清液，再以预冷PBS洗涤2～3次，加入1mL培养液重悬；

（9）台盼蓝染色计数活细胞百分率；

（10）常规法计数细胞，并以预冷培养液调浓度至（1～3）×10⁶个/mL备用。

实验结果

倒置于显微镜下可见到典型的巨噬细胞贴壁生长，有梭形伪足。

注意事项

（1）在腹腔细胞冲洗和洗涤以及重悬的操作过程中，注意实验器材和溶液的预冷，防止巨噬细胞贴附于实验器皿而导致细胞损耗；

（2）操作过程中严格注意无菌操作。

思考题

本实验中，可采用哪些方法提高巨噬细胞的获得率？