小鼠胸腺细胞的制备

实验五　小鼠胸腺细胞的制备

实验目的

掌握小鼠胸腺细胞的获取方法。

实验原理

胸腺一般位于胸骨后、心脏上方的前纵隔内，由两叶不对称的淡红色或略带黄色的薄片样组织构成。胸腺是T淋巴细胞发育和成熟的场所，因此可作为获得大量小鼠T淋巴细胞的来源器官。

实验材料

（1）6～8周龄Balb/c或昆明种小鼠；

（2）RPMI－1640培养液；

（3）胎牛血清；

（4）Hanks液（无Ca^2＋/Mg^2＋）；

（5）0．4%台盼蓝染液；

（6）温控低速离心机；

（7）显微镜；

（8）细胞计数板、离心管、50mL塑料针筒、钢丝网、剪刀、无菌注射器芯、平皿、镊子、离心机等。

实验方法

（1）颈椎脱臼法处死小鼠；

（2）70%乙醇浸泡10s；

（3）固定小鼠四肢，以眼科剪在胸骨区皮肤剪一小切口，由此切口撕裂皮肤并暴露胸骨；

（4）70%乙醇冲洗暴露部位；

（5）眼科剪剪断心脏前方胸骨及两侧肋骨，由心脏上方的前纵隔内取出胸腺；

（6）用剪刀剔除结缔组织和脂肪后，将胸腺置于装有Hanks液的平皿内，用无菌注射器芯将组织轻轻挤压通过60～100目（孔径为0．28～0．154nm）的钢丝网，吸取Hanks液冲洗钢丝网；

（7）将细胞悬液再依次通过150目（孔径为0．1nm）和600目（0．02nm）的钢丝网。收集富含细胞的Hanks液于试管中，2000r/min离心5min。低渗处理红细胞。然后用Hanks液洗涤2次，每次1 000r/min离心10min。

（8）弃上清液，细胞计数，完全培养基重悬细胞，调细胞浓度至1×10⁶个/mL，备用。

注意事项

（1）操作过程中，细胞均置于0～4℃冰浴中。

（2）分离淋巴结的淋巴细胞时，红细胞极少，可通过低渗处理红细胞。

（3）因胸腺对有害的因素十分敏感，故洗涤时用含0．5%明胶的Hanks液。制备人胸腺细胞悬液时可将过网后的细胞悬液再通过密度梯度离心法来获取PBMC，PBMC中的胸腺上皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞等可通过黏附法或其他方法去除。

思考题

本实验中，可通过哪些措施减少对T淋巴细胞的刺激和损伤？