小鼠骨髓树突状细胞的制备

实验六　小鼠骨髓树突状细胞的制备

实验目的

掌握小鼠骨髓树突状细胞的制备方法，熟悉小鼠骨髓来源树突状细胞的形态。

实验原理

目前，树突状细胞还没有可传代的细胞株，一般采取两种办法来获取树突状细胞，一种是直接分离法，即根据树突状细胞的低密度和半贴壁特性，以及其他细胞缺乏树突状细胞特定的细胞表面标志来直接分离提取树突状细胞。另一种方法是利用细胞因子诱导、扩增树突状细胞，即通过不同组合的细胞因子诱导不同组织以分化扩增出大量高纯度的树突状细胞。

实验材料

（1）6～8周龄Balb/c或昆明种小鼠；

（2）RPMI－1640培养液，重组小鼠粒－巨噬细胞集落刺激因子（rmGM－CSF）；

（3）胎牛血清；

（4）PBS（无Ca^2＋/Mg^2＋）；

（5）0．4%台盼蓝染液；

（6）温控低速离心机；

（7）显微镜；

（8）细胞计数板、离心管、6孔塑料培养板、50mL塑料针筒、剪刀与镊子等。

实验方法

（1）采用颈椎脱臼法处死小鼠，在75%乙醇中浸泡2～3min后，置于无菌平皿中，剪开皮肤。取出双侧股骨，用无菌的生理盐水（或RPMI－1640）清洗2～3次后，剪开股骨两端，以1mL注射器抽取RPMI－1640液将骨髓细胞冲入15mL离心管中；

（2）轻轻将骨髓细胞吹打开，并充分悬浮，静置5min，转入另一15mL离心管中，1200r/min，离心10min；

（3）弃上清液，细胞沉淀按1∶10体积比加入Tris－NH4CL缓冲液，轻轻吹打混匀，室温静置5min；

（4）1200r/min离心10min，弃上清液，RPMI－1640洗涤2次；

（5）计数细胞后，以RPMI－1640调整细胞浓度为（0．5～1）×10⁵个/mL，加入六孔培养板中，每孔2mL；

（6）37℃、5%CO₂条件下，饱和湿度下贴壁培养24h；

（7）吸弃上清液，用37℃预温的RPMI－1640轻轻洗去非贴壁的细胞，每孔加入2mL含0．02g/mL重组小鼠粒－巨噬细胞集落刺激因子（rmGM－CSF）的完全培养液继续培养；

（8）隔两日半定量换液，小心弃去悬浮细胞，轻轻转动培养板，防止细胞聚集。

实验结果

倒置显微镜下可见贴壁细胞边缘向四周伸出大量突起，部分细胞悬浮，边缘可见绒毛状突触。

注意事项

（1）切勿在2h左右即急于去除悬浮细胞；应至少在24h以后再去除悬浮细胞，以免绝大部分贴壁细胞未贴壁即被去除；

（2）骨髓细胞不要过细胞筛，以免大部分树突状细胞的前体细胞被细胞筛黏附，可用带针头的注射器吸打几次以分散细胞团块；

（3）冲洗股骨和胫骨时勿剪去两端的骨松质，因为前体细胞主要驻存于此，可用进口的1mL注射器，它的针头比较好，不但可刺穿骨头，还不易变钝；

（4）可用Tris－NH₄Cl红细胞裂解液裂解红细胞，时间应控制在1min左右；

（5）一般认为，用C57小鼠分离、培养树突状细胞（DC），无论数量还是形态都比Balb/c小鼠明显要好。

思考题

比较直接分离法和细胞因子诱导法获得树突状细胞的优缺点。