淋巴细胞溶血空斑实验（）

实验四　B淋巴细胞溶血空斑实验（PFC）

实验目的

掌握PFC的实验原理、实验操作及实验结果观察。

实验原理

溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法。它是将经绵羊红细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃条件下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体形成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑实验具有特异性高、筛选力强、可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。

实验材料

（1）材料平皿，温箱，水浴箱，离心机，显微镜及细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。

（2）试剂如下。①SRBC悬液：取无菌脱纤绵羊血（或阿氏液保存的血液），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗3次，每次2000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌后pH值为7．2的PBS（含Ca^2＋、Mg^2＋）中，使其浓度为20%，经细胞计数后，调整细胞浓度为2．0×10⁹个/mL。②补体：采集3只或3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1∶30的浓度。

实验方法

（1）免疫脾细胞悬液的制备　①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液0．2mL；②脾细胞悬液的制备：将免疫后第4天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入含Ca^2＋、Mg^2＋pH值为7．2的冷的PBS中漂洗后，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用弯头镊子挤压脾细胞，稍静置，吸取上清液至离心管中，1 500r/min离心5min，弃上清液后，定量加入PBS，混匀，按白细胞计数法计算脾细胞数，最后用PBS调整细胞数至1．0×10⁷个/mL，一般每只鼠脾脏细胞数为1×10⁸～1．5×10⁸个。

（2）倾注底层琼脂　将1．4%琼脂凝胶加热熔化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿2～3mL，凝固后，置于37℃温箱中，平皿反扣，开盖1h后备用。

（3）顶层琼脂的制备　将0．7%的琼脂熔化后，置于45℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂。①2．0×10⁹个/mL SRBC悬液0．1mL；②1%DEAE－右旋糖酐0．05mL；③1．0×10⁷个/mL脾细胞悬液0．1mL。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，于37℃温育1～1．5h。

（4）加补体　从温箱中取出平皿，每皿加入1∶30稀释的新鲜豚鼠血清1．5mL（如未加DEAE－右旋糖酐，则加原血清或1∶5稀释的新鲜血清1．5mL），继续放于37℃温箱中温育30min，取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱中过夜，次日观察结果。如需保存，可加入用生理盐水或用PBS配制的0．25%戊二醛6mL进行固定。

实验结果

观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。

注意事项

（1）因为SRBC既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，绵羊红细胞要新鲜，若发现形态改变或颜色呈褐色，应弃去不用。

（2）为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hanks液），最好临用时才从4℃冰箱中取出，或整个操作过程在冰浴中进行。Hanks液的pH值的高低对脾细胞分泌抗体的影响很大。

（3）绵羊红细胞洗涤次数不宜超过3次，离心速度应在2000r/min之内。

（4）计数空斑数时力求克服主观性，避免辨认造成的误差。遇可疑空斑时，应镜检，对肉眼结果进行核对。

思考题

什么是溶血空斑实验？有哪些方法？原理是什么？