抗原血清学分型

实验一　HLA抗原血清学分型

实验原理

淋巴细胞表面存在HLA抗原，当HLA特异性抗体（IgG或IgM）与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原特异结合后，能够激活补体产生细胞膜损伤，导致细胞死亡，染料进入死细胞，使细胞体积增大并着色；而不带有相应HLA抗原的淋巴细胞，则无此作用，仍然存活，不着色，活细胞具有折光性，大小正常。根据淋巴细胞死亡率确定受检细胞有无相应的HLA抗原以及抗原抗体反应的强度。

实验材料

已加好HLAⅠ或HLAⅡ类分型血清的微量反应板，微量加样器，水平离心机，倒置相差显微镜，超低温冰箱，淋巴细胞分离液，待检血清，阳性对照血清，阴性对照血清，冻干标准补体或新鲜家兔混合血清，5%的曙红水溶液，18%的中性甲醛，25℃恒温箱。

实验方法

（1）按常规方法分离淋巴细胞。取肝素抗凝血3～5mL，用等量Hanks液或生理盐水稀释，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的试管中，2000r/min离心15～20min，吸取分离液上的白膜层至另一试管中，Hanks液或生理盐水洗涤三次，用RPMI－1640培养基调整细胞浓度至2．5～3×10⁶个/mL。

（2）从超低温冰箱中取出HLAⅠ类分型反应板，待其融化，记上标记。

（3）用软滴法，每孔加入淋巴细胞悬液1μL（细胞浓度为（2．5～3）×10⁶个/mL），并与血清混和（可用小棒搅动使之混合），25℃孵育30min。

（4）每孔加入兔补体5μL，25℃孵育60min。

（5）每孔加5%的曙红水溶液5μL，染色2～10min。

（6）每孔加入18%的中性甲醛5μL，固定。

（7）静置2h或置于4℃处过夜，使细胞充分沉到孔底后，轻轻盖上玻片，在倒置相差显微镜下读数。

实验结果

结果判断原则：阳性对照死亡细胞应大于80%，阴性对照死亡细胞应小于2%左右。

估计死细胞占全部细胞的百分比，可以反映出抗原与抗体反应的强度。国际通用的判断方法为NIH记分法（表9－1）。

表9－1　NIH读数记分标准

注意事项

（1）要求微量反应板本身对细胞无毒性。

（2）淋巴细胞悬液要求至少有90%以上的细胞活力，红细胞和多形核白细胞污染不超过10%。

（3）细胞和血清要充分混合。

（4）盖上玻片时，注意不要使气泡进入反应孔而导致无法观察。

（5）应避免兔补体受热或反复冻融而失去活性。

（6）反应温度应控制在25℃或室温。

（7）HLA－Ⅱ类抗原所用细胞悬液应富含B淋巴细胞，比例大于60%，在阴性对照中死细胞不超过10%～20%或更低。

思考题

（1）HLAⅠ类和Ⅱ类分子在结构、组织分布和与抗原肽作用等方面各有何特点？

（2）用血清学分型法检测HLA－Ⅱ类抗原与检测Ⅰ类抗原，有哪些主要的不同点？