技术（正向杂交）

实验七　PCR/SSO技术（正向杂交）

实验原理

将PCR扩增产物经0．4mol/L NaOH溶液变性后，固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用同位素（³²P）或非同位素（地高辛、HRP）标记的序列特异性寡核苷酸在适当温度下作斑点杂交，根据不同的标记物采用相应的检测方法显现杂交信号，由此判断待测样本的基因型别。

实验材料

PCR扩增产物；硝酸纤维素膜或尼龙膜；塑料袋；点膜器；烤箱；T4多核苷酸激酶；［γ－32P］ATP；SSO探针；杂交缓冲液（6×SSPE，5×Denhardt，0．5%的SDS）；10×SSPE缓冲液；SDS；NaOH；温箱；恒温摇床；－70℃冰箱；X光片；暗盒。

实验方法

（1）PCR扩增等位基因：方法同实验八相关内容。

（2）制点。

①将尼龙膜裁剪成所需的大小，浸于30～40℃温水中预温5min，再于10×SSPE中浸泡15min。

②60℃干燥尼龙膜（约30min），放入点膜器中。

③按标本顺序点样，每个点2～3μL扩增产物。

④室温干燥尼龙膜。

⑤将尼龙膜放入0．4mol/L的NaOH溶液中变性5min。

⑥再浸入10×SSPE中10min。

⑦将膜取出放于滤纸上，并吸去多余的液体，80℃烤膜1h或254nm紫外灯照射5 min，充分干燥尼龙膜，装入塑料袋备用。

（3）寡核苷酸的32P标记：反应体系的建立及扩增反应如下。

37℃孵育30～40min，加入1μL0．5mol/L的EDTA（pH值为8．0）终止反应。标记的探针可直接使用。

（4）预杂交：将装有点好的尼龙膜的塑料袋中加入10mL杂交液中，封口，于42℃摇床预杂交2h。

（5）杂交：剪开塑料袋一角，加入32P标记的SSO探针0．5pmoL/L杂交液，封口，于42℃水浴摇床振荡2～16h。

（6）洗膜。

①取出膜，于100mL 2×SSPE/0．1%SDS中室温洗膜10min，洗2次；

②于100mL 6×SSPE/1%SDS中在探针Tm温度下洗膜10min，洗2次（Tm＝4×SSO中GC的数量＋2×SSO中AT的数量）。

（7）放射自显影及结果分析。

①取出杂交膜置于滤纸上，吸去多余的液体，放入塑料袋内，室温下加增感屏后暴露在X光片上。

②暗盒置于－70℃放射自显影1～5h或过夜。

③经显影定影，根据杂交结果分析HLA的等位基因。

注意事项

（1）80℃干燥尼龙膜的时间不宜过长，以免将尼龙膜烤碎。

（2）制点时DNA样本的量不宜太大，以免出现假阳性。

（3）注意放射性防护，避免同位素污染。

（4）严格控制洗膜的条件，洗膜应充分，以减轻非特异性结合和降低本底着色。

（5）杂交液、洗膜液最好在临用前配制。

思考题

简述PCR/SSO技术的优缺点及实验中的注意事项。

（余　平）

参考文献

［1］谭建明，周永昌，唐孝达．组织配型技术与临床应用［M］．北京：人民卫生出版社，2002．

［2］赵桐茂．HLA分型原理和应用［M］．上海：上海科学技术出版社，1984．