抗血清的制备

单元二　抗血清的制备

目前临床应用的抗体按其制备的原理分为三类，一类为动物免疫血清即抗血清，是将制备好的免疫原按照一定程序免疫动物，分离动物血清获得的针对某一抗原多种表位的抗体，也称多克隆抗体；第二类是通过杂交瘤技术制备的针对某一抗原分子中一种抗原表位的单克隆抗体；第三类是利用基因工程技术制备的基因工程抗体。本单元主要介绍抗血清的制备。

抗血清的制备大致分为三个阶段，即免疫原的制备、动物免疫和血清的分离、纯化与鉴定。

一、制备抗原

抗原是制备抗血清的重要物质基础，抗原的质量影响着免疫效果及免疫特异性，因此必须根据不同的抗原性质，采用不同的方法制备出免疫原性强、纯度高的抗原。其制备方法见本任务单元一。

二、免疫动物

（一）免疫用动物的选择

哺乳类和禽类是制备免疫血清的主要接种动物，常用的有兔、绵羊、马、豚鼠和鸡。具体选择动物时应考虑以下因素。

1.动物种属的选择　一般而言，抗原的来源与免疫动物种属差异越大，免疫原性越强，免疫效果越好。同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差，如鸡与鸭。

2.动物个体的选择　免疫动物个体必须适龄、健康、无感染性疾病，体重符合要求。如家兔应选择6月龄以上，体重2～3kg为宜。一般选用雄性动物，雌性动物尤其是妊娠动物可因诸多因素影响抗体的产生。

3.抗原的性质与动物应答敏感性　不同性质的免疫原，适宜的动物亦不相同。蛋白质类抗原对多数动物皆适合，常选用家兔和山羊。但若动物体内含有与蛋白抗原类似的物质，则对这些动物免疫原性差，如IgE对绵羊、多种酶类（如胃蛋白酶等）对山羊、胰岛素对家兔等免疫后就不易出现抗体。此时可以通过改变抗原的剂型或选择其他动物（如豚鼠等）进行试验。其他类免疫原（如类固醇激素）免疫时多选用家兔，而酶类免疫多用豚鼠。

4.抗血清的要求　根据免疫的动物种类不同，抗血清分为R（兔）型及H（马）型。R型抗血清是用家兔及其他动物免疫产生的抗体，抗原抗体反应比例合适，范围较宽，适用于诊断试剂；H型抗血清是用马等大型动物免疫获得的抗体，抗原抗体反应比例合适范围较窄，一般用作免疫治疗。除依据抗血清的用途选择动物外，也可从所需抗体的数量考虑，抗体需求量大，可选用马、绵羊等大型动物，抗体需求量少，可选用家兔或豚鼠。

（二）免疫方案的制订与实施

依据抗原的性质、抗血清制备的不同要求来设计行之有效的免疫方案，其内容包括抗原的剂量、接种途径、次数、免疫间隔时间和佐剂等，这些因素均关系到免疫的成功与否。

1.抗原的剂量　抗原剂量的确定应考虑抗原免疫原性的强弱、相对分子质量大小、动物的个体状态以及免疫途径和免疫佐剂种类等因素。剂量过小、免疫效果差，过大易产生免疫抑制，适宜剂量范围内，免疫原的剂量越大，免疫反应越强，产生的抗体效价越高。一般大动物抗原剂量为0.5～1mg/（只·次），小动物为0.1～0.6mg/（只·次）。用半抗原免疫时，半抗原的载体应始终相同，避免影响抗体的产量或改变抗体类别。是否使用佐剂，依抗原性质而定，颗粒性抗原具有强免疫原性，一般不用，也不易诱发免疫耐受。可溶性抗原则要加入，但应注意免疫耐受现象的发生。

2.免疫途径　常用的免疫途径有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结。初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选择静脉注射或腹腔注射。可溶性抗原常采用皮下及皮内免疫时多点注射，包括脚掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、耳后以及颌下等，每点注射量不宜超过0.5mL，以免引起局部无菌性坏死和脓肿。宝贵抗原可选择淋巴结内微量注射，仅需10～100μg抗原。半抗原宜用皮内多点注射。

3.免疫次数与周期　应根据抗原的性质、抗原免疫原性的强弱、动物个体状态等因素确定，一般免疫的总次数为3～8次。免疫间隔时间也是影响抗体产生的重要因素，尤其是首次与第二次免疫的时间间隔，因首次免疫后，机体处于识别抗原和B细胞增殖阶段，若很快进行第二次注射，易造成免疫耐受，间隔太长，则使刺激变弱，抗体效价不高，故以10～20天为佳。第三次及以后的间隔一般为7～10天。随着免疫次数的增加，有些抗原尤其是可溶性抗原的免疫，要防止动物过敏或死亡，在注射7～10天以后，要考虑脱敏措施（即少量多次注射）。

三、抗血清收获

动物免疫3～5次后，可取少量血清检测抗体效价与特异性，测试合格后，应在末次免疫后5～7天及时采血分离。若抗血清效价不理想，可追加免疫1～2次后再行采血。为防止血脂过高，采血前动物应禁食24h。

（一）采血

目前常用的动物采血方法有三种。

1.颈动脉放血法　该法最常用，常用于家兔、绵羊、山羊等动物的采血。以家兔为例，在家兔颈部行皮肤切口，分离出颈动脉，用带橡皮管的穿刺针头刺入动脉，使血液经橡皮管流入无菌瓶，放血时用止血钳夹持橡皮管控制血流速度。另一种方法是分离颈动脉后，将无菌导管插入颈动脉近心端引血入瓶。一般一只家兔可放血50～100mL。放血时应避免速度过快，否则动物很快死亡，取血量减少。

2.心脏采血法　此法常用于家兔、豚鼠、大鼠等小动物采血。将动物仰卧或垂直位固定，消毒，触摸胸壁探明心脏搏动最明显处后，将注射器由该处刺入，抽取血液。一般1只家兔1次可取血20～30mL。本法要求操作熟练，否则穿刺不当易引起动物死亡。

3.静脉采血法　该法可多次进行和采集较多的血液。如绵羊颈静脉采血，一次能采血300mL，采血后立即回输10%葡萄糖生理盐水，能在短时间恢复动物的体能，3天后仍可采血200～300mL。让动物休息一周，加强免疫一次，又可采血2次。家兔在耳中央静脉处取血，小鼠在眼底静脉丛处取血，小鼠还可采取摘除眼球或断尾法甚至断头法采血。

（二）分离收集血清

采集的动物血液应及时分离血清，分离方法常采用室温自然凝固，然后置37℃或4℃中使血块收缩后，再收集血清。前者血块收缩迅速，但所得血清较少；后者血块收缩慢，时间较长，有时会出现溶血，但获血清多且效价不会下降。血清若混入红细胞，需离心沉淀除去。整个过程要防止污染和溶血。

（三）抗血清纯化

在制备抗血清的过程中，往往由于抗原不纯，含性质相近的杂抗原较多，加之自然免疫的影响，常有杂抗体的产生，即是使用高纯度的抗原（如IgG）免疫动物，抗血清仍有抗重链及抗轻链抗体。此外，有些目的蛋白质与其他蛋白质结合在一起，免疫得到的抗血清也是含有抗其他蛋白的杂抗体。因此抗血清获取后，需根据要求选用不同的方法（如亲合法、吸附法等）提纯目的抗体，除去非目的抗体或非特异干扰成分，这种经纯化、吸收处理后，去除杂抗体，只与其特异性抗原发生反应的抗血清，称为单价特异性抗血清。

有时在实际应用中需要高纯度、特异性强的免疫球蛋白进行免疫学检测、治疗，因此，所得的抗血清还需进行免疫球蛋白分类的纯化。操作时可根据实验室条件、纯化的种类（如IgG、IgM、γ球蛋白、F（ab′）₂等）不同选择适当的提纯方法（详见本任务单元一）。

四、抗血清的鉴定和保存

（一）抗血清的鉴定

1.抗血清效价的测定　抗血清效价代表了血清中所含抗体的浓度或含量。可用试管凝集反应、琼脂双向扩散、ELISA和放射免疫法等，应用棋盘滴定，确定抗体的效价。

2.抗体特异性的鉴定　应根据抗原性质来选择不同方法。用颗粒性抗原制得的抗体，分别与抗体相对应的已知抗原（目的抗原）和相似抗原做玻片凝集试验。如果只与目的抗原反应，说明特异性强，如与两种抗原都发生反应，则说明抗体不纯，有交叉反应，可用相关抗原进行吸收试验处理，去除共同抗体，提高其特异性。

用可溶性抗原制得的抗体，常用双向免疫琼脂扩散、免疫电泳、免疫转印等技术来分析。若抗血清与混合抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，而且两条沉淀线融合，证明此动物已产生单价特异性抗体。如与纯化抗原出现一条，与混合抗原出现多条沉淀线，而其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线融合，表示免疫成功，但有杂抗体存在，需进一步纯化处理，可得到单价特异抗体。若没有沉淀线，表示免疫失败。

3.抗体纯度的鉴定　鉴定方法可用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）、双向琼脂扩散、免疫电泳等方法。依据出现的电泳区带与沉淀线分析抗体的纯度。

4.抗体亲和力的鉴定　抗体亲和力是指抗体与抗原结合的强度，常以亲和常数K表示。一般采用平衡透析法、ELISA和放射免疫技术等进行测定。亲和力鉴定对抗体的筛选、确定抗体的用途、验证抗体的均一性等具有重要意义。

（二）抗血清的保存

抗血清除菌后一般用小份包装保存，保存的方法常用以下3种。①4℃保存，液体状态下保存于普通冰箱，可存放3～6个月；效价高时，可存放一年，若放置过长，应重新鉴定效价。保存时需加入1～2g/L　NaN₃和一定浓度的甘油，前者用以防腐，后者可延长保存期。②低温保存，存于－40℃～－20℃，在3～5年内效价下降不明显，应避免反复冻融，否则效价明显降低。③真空干燥，用真空冻干机除去抗血清的水分，使最后制品内水分＜0.2%，封装后可长期保存，在冰箱中可保存5～10年。