间接凝集反应

单元二　间接凝集反应

间接凝集反应也称为被动凝集反应，是将可溶性抗原或抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的抗原或抗原结合，在适宜电解质条件下，出现凝集现象。吸附有抗原或抗体的载体，称为致敏颗粒或免疫微球。

载体是与免疫无关的颗粒，不溶于水，在生理盐水中性质稳定，短时间内不会下沉，并能牢固吸附抗原或抗体而不影响其特异性。可用作载体的颗粒种类很多，常用的有红细胞、多种惰性颗粒如聚苯乙烯胶乳、活性炭粉、明胶颗粒、白陶土、火棉胶和细菌等。根据载体种类的不同，分别称为红细胞凝集（简称血凝试验）、胶乳凝集试验（乳凝试验）、炭粉凝集试验（炭凝试验）、明胶凝集试验等。可溶性抗原可以是病原体的可溶性蛋白、人体蛋白、激素、各种组织器官浸出液、细胞裂解液、植物蛋白质如花粉浸出液等。

间接凝集反应增加了载体，加大了可溶性抗原或抗体的体积，当微量抗原与抗体结合后，就足以出现肉眼可见的凝集反应。因此间接凝集反应的优点是比直接凝集反应灵敏度高，通常高2～8倍。但特异性较差。可用于微量抗体或抗原的检测。

一、反应类型

目前常用的间接凝集试验有正向间接凝集试验、反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验。

（一）正向间接凝集试验

1.原理　正向间接凝集试验是将已知可溶性抗原与载体颗粒结合，测定未知抗体，出现凝集现象为阳性，无凝集现象为阴性（图7－4）。

图7－4　正向间接凝集试验原理示意图

2.应用　测定抗体，如间接乳凝试验检测类风湿因子、间接炭凝试验检测梅毒反应素。

（二）反向间接凝集试验

1.原理　反向间接凝集试验是将已知抗体吸附于载体上，测定未知可溶性抗原，出现凝集现象为阳性，无凝集现象为阴性（图7－5）。

2.应用　测定抗原，本试验快速、简便、敏感性高、特异性强。临床上用于检测乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、新型隐球菌荚膜抗原等。

图7－5　反向间接凝集试验原理示意图

（三）间接凝集抑制试验

1.原理　间接凝集抑制试验是预先用可溶性抗原封闭抗体的抗原结合位点，使吸附在载体上的可溶性抗原不能与抗体结合而出现不凝集现象。

在试验时先加入被检标本和已知抗体混合，再加入已知可溶性抗原吸附的载体。若被检标本中有可溶性抗原与已知抗体结合，则占据了抗体的抗原结合位点，使得后加入的载体－可溶性抗原无抗体结合，结果为载体不能凝集，为阳性；若标本无抗原，已知抗体的抗原结合位点即可与后加入的载体上的抗原结合，结果为载体凝集，为阴性（图7－6）。

图7－6　间接凝集抑制试验原理示意图

2.应用　测定可溶性抗原。如胶乳凝集抑制试验，用于检测孕妇尿液中的绒毛膜促性腺激素（HCG），协助诊断早期妊娠。

二、间接凝集技术应用

间接凝集反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测。在临床检验中最常用的间接凝集试验为间接血凝试验和胶乳凝集试验。间接凝集反应用具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点，而且能用于抗原或抗体的测定，因此在临床检验中广为应用。

1.抗原的检测　反向间接凝集试验用于检测病原体可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。

2.抗体的检测　可用于检测细菌、病毒和寄生虫等感染后产生的抗体，如：间接凝集试验或明胶颗粒凝集试验用于检测人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断艾滋病；胶乳凝集试验用于检测抗体、溶血素“O”等；将全病毒抗原及重组抗原吸附在粉红色明胶颗粒上，用于检测相应抗体。

三、间接凝集技术案例

（一）链球菌溶血素“O”测定

【要求】

（1）掌握链球菌溶血素“O”测定技术。

（2）能正确判断结果，规范出具报告。

【用途】

（1）测定病人血清中抗链球菌溶血素“O”抗体含量。

（2）用于风湿热、急性肾小球肾炎等与链球菌感染有关疾病的辅助诊断。

【内容】

抗“O”试验——ASO胶乳法。

【相关知识点】

（1）链球菌溶血素“O”的特性：链球菌能产生溶血毒素，其中链球菌溶血素“O”（streptolysin O，SLO），对血小板、巨噬细胞、神经细胞、心肌细胞有毒性作用。SLO免疫原性强，85%～90%链球菌感染的患者，于感染后2～3周至病愈后数月到一年内能检出高滴度抗体。因此测定SLO抗体（抗“O”）含量，可作为链球菌感染或风湿热活动的指标之一。

（2）检测原理：ASO胶乳法是中和反应与正向间接凝集试验相结合的反应类型。在受检血清标本中，加入适量的溶血素“O”。如标本中含有高浓度的抗体，与溶血素“O”中和后则有多余的抗体存在，经与溶血素“O”致敏的胶乳试剂反应，可出现清晰而均匀的凝集颗粒。

（3）抗“O”动态变化：正常人体内因隐性感染等原因可有低滴度的抗“O”抗体，其效价一般＜1∶200，只有当感染时，才会产生高效价的抗“O”抗体，这时ASO胶乳法测定，才会有多余抗体被检出，一般抗体水平＞1∶400以上。

【准备】

（1）试剂：溶血素O溶液、ASO胶乳试剂、阳性控制血清、阴性控制血清等。

（2）其他：待检血清、洁净玻片、生理盐水等。

【操作步骤】

（1）灭活补体：待检血清用生理盐水1∶50稀释，56℃灭活30min。

（2）加待检血清和对照：取一块洁净的载玻片，左侧加阴性对照1滴，右侧加待检血清1滴。

（3）加诊断试剂：在左右两侧分别滴加溶血素“O”一滴，轻轻摇动2min。再分别滴加ASO胶乳试剂1滴，轻轻摇动，反应3min后，观察结果（图7－7）。

【注意事项】

（1）试剂的添加顺序不能颠倒。

图7－7　ASO胶乳试验操作流程示意图

（2）反应时间应充足。

（3）应在室温下进行。

【结果判断】

（1）该试验以凝集结果为阳性反应。凝集说明抗“O”抗体至少大于1∶400。

（2）提高待检血清稀释度，再进行ASO胶乳测定仍阳性者，临床意义更大。

（3）报告。若实验结果为凝集，则报告：抗“O”试验（＋）。若实验结果为不凝集，则报告：抗“O”试验（－）。

【结果分析及临床意义】

抗“O”试验用于链球菌感染或风湿热的辅助诊断。风湿热患者血清中抗“O”抗体比正常人显著增高，活动性风湿热患者一般超过1∶400。

（二）梅毒螺旋体感染的检测

【要求】

（1）掌握快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）的操作方法。

（2）能正确判断结果，规范出具报告。

【用途】

（1）此试验快速、简便，适用于大量的筛查体检。

（2）可用于梅毒的辅助诊断及疗效观察。

【内容】

快速血浆反应素环状卡片试验（RPR试验）。

【相关知识点】

（1）梅毒螺旋体与机体免疫反应：梅毒螺旋体是梅毒的病原体，侵入人体48h后，血液中即可产生特异性抗体，2周后即可用免疫学方法测出。最初可测出IgM抗体，继之可检出IgA和IgG。除IgM外，其他抗体可在机体内长期存在。梅毒螺旋体感染人体后，患者血清中可出现两类抗体：一类为抗梅毒螺旋体的特异性制动抗体，当有补体存在和厌氧条件下对活体梅毒螺旋体有制动作用，并能将螺旋体杀死或溶解；另一类则是由梅毒螺旋体感染人体后，受损组织所释放的一种物质，即心磷脂刺激机体产生的抗体。此类抗体能与广泛分布于生物组织中的类脂质抗原发生非特异反应，故称其为反应素。反应素对机体无保护作用，无抗体活性。

（2）RPR试剂组成：牛心肌类脂质含有心磷脂，可替代受损组织释放的心磷脂（共同抗原有效成分），经过加工处理后，制成心磷脂－胆固醇－卵磷脂复合物成为RPR抗原，吸附在活性炭表面即成致敏颗粒。

（3）RPR试验原理：将待检血清、致敏的活性炭颗粒（吸附有RPR抗原）置于RPR卡片上反应，观察是否出现黑色的凝集颗粒或絮片。其设计原理为非特异性正向间接凝集反应，是交叉替代抗原－“抗体”反应。

【准备】

（1）RPR试剂盒　包括：①RPR抗原（吸附于活性炭的类脂质抗原）；②RPR卡片（印有12个直径为18mm圆圈的特制涂料卡片）；③塑料加液滴管（每滴50μL）；④阴阳性对照。

（2）其他　标本（待测血清）、器材（微量加样器）。

【操作步骤】

（1）阳性对照血清、阴性对照血清各1滴加于环状卡片上。

（2）待检血清滴管50μL于卡片圆圈内。

（3）用塑料加液滴管在上述每份血清上各加1滴RPR抗原。

（4）旋转摇动卡片8min，使充分混匀。

（5）立即在光亮处直接观察结果。

【注意事项】

（1）本试验应在室温环境20～25℃条件下进行。

（2）抗原与被检血清要充分混匀，如从冰箱中取出应复温后再做试验。

（3）标本存放不当（如细菌污染或溶血），易出现假阳性。

（4）抗原与被检血清混匀后8min观察结果，延长时间易出现假阳性。

【结果判断】

（1）阳性：待检标本出现明显黑色凝集颗粒或絮片。

（2）阴性：待检标本无黑色凝集出现。

【结果分析及临床意义】

（1）交叉反应：本类试验虽敏感性较高，但所用抗原是非特异性类脂抗原，除梅毒病以外，其他螺旋体病（雅司、回归热）、麻风、红斑狼疮、非典型肺炎、类风湿关节炎、肝硬化等亦可查出反应素，称梅毒血清生物学假阳性（交叉反应结果）。故对结果的解释应加以注意。

（2）RPR试验阳性反应的意义：为非特异性试验，用以检测梅毒患者血清反应素。阳性见于梅毒密螺旋体感染。在下疳早期血清试验阴性时称血清阴性下疳，下疳后期血清试验阳性，称血清阳性下疳。下疳1～2周和2期梅毒阳性率可达100%，晚期梅毒阳性率为70%～80%。

由于机体在感染梅毒螺旋体后，血清反应素在第1期梅毒病变出现后1～2周即可开始测出，在梅毒第2期患者血清反应素滴度最高，试验阳性率几乎可达100%。第3期梅毒患者的阳性率相对较低，经药物治疗后血清反应素首先转阴。由此可见，血清反应素变化曲线与梅毒临床过程一致。故本试验不仅对疾病的早期诊断有用，还可应用于梅毒患者的疗效监测。

（三）人绒毛膜促性腺激素（HCG）检测

【要求】

（1）掌握间接凝集抑制试验法测HCG的操作技术。

（2）能正确判断结果，规范地出具报告。

【用途】

（1）本试验主要用于妊娠的诊断。

（2）用于与妊娠相关疾病和肿瘤的诊断及鉴别诊断。

【内容】

间接凝集抑制试验法测定HCG。

【相关知识点】

（1）HCG：HCG即人绒毛膜促性腺激素，是由胎盘绒毛膜滋养层细胞分泌的一种糖蛋白。HCG在受精后第六天前后就进入母血，并快速增高一直到孕期的第8周，然后浓度缓慢降低直到孕期的第18～20周，然后维持10天左右，再开始下降（但仍高于正常水平）。用敏感的方法，2～6天受孕即呈现阳性。

（2）原理：属于间接凝集抑制试验法。该试验是利用已知抗原致敏的颗粒与待检标本中可溶性抗原竞争有限抗体的经典方法。若标本中含有相应抗原，则与抗体结合，阻断了致敏颗粒表面抗原与抗体的结合，不出现凝集现象。

【准备】

（1）材料：孕妇尿液、非孕妇尿液（对照）、抗－HCG血清、致敏的HCG胶乳抗原。

（2）其他：洁净玻片、吸管等。

【操作步骤】

（1）加样本：用吸管吸被检孕妇尿液1滴于载玻片左侧，非孕妇尿液（对照）加于载玻片右侧。

（2）加已知抗体：另取一滴管在左、右侧各加抗－HCG（抗－绒毛膜促性腺激素）血清1滴，混匀，反应1～2min。

（3）加致敏颗粒：HCG胶乳抗原各1滴于左右两侧液滴中，缓慢摇动3～5min，置黑色背景下肉眼观察。

【注意事项】

（1）待检尿液以晨尿为好。

（2）试剂使用前应在室温下预温并摇匀。

（3）待检标本和试剂应按规定顺序和时间加入。

（4）加入试剂时液滴大小应均匀、一致。

【结果判断】

（1）该试验以不凝集结果为阳性反应。

（2）报告：均匀浑浊乳状，则报告“妊娠试验阳性”；出现白色细小凝集颗粒，则报告“妊娠试验阴性”。

【结果分析及临床意义】

（1）早期妊娠的诊断。

（2）在宫外孕时，在子宫出血后3天仍可为阳性，可用HCG与其他急腹症鉴别，但其只有60%左右的阳性率。

（3）不完全流产时HCG检测仍可为阳性，完全流产或死胎时则由慢性转阴。

（4）用于产后或人流术后情况的判断。如在一定时间内未恢复则应考虑异常可能。

（5）患葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌及睾丸畸胎癌等疾病时，HCG可显著增高。

（6）应用于肿瘤术后观察。

（7）患内分泌疾病（如甲状腺功能亢进症）、脑垂体疾病、卵巢肿瘤、子宫癌、胃癌、肝癌等疾病时，HCG也可升高。