液相内沉淀试验

单元一　液相内沉淀试验

液相内沉淀试验是指以缓冲液为反应介质，在其中进行的抗原－抗体特异性结合反应。目前，临床上常用的液相内沉淀试验是絮状沉淀试验（flocculation）和免疫浊度测定（immunoturbidimetry）。

一、絮状沉淀试验

1.基本原理　在适当条件下，可溶性抗原、抗体在液相中发生特异性结合，形成肉眼可见的絮状沉淀物。

2.技术要点

（1）抗原稀释法：将可溶性抗原作一系列倍比稀释后，每管加入恒定浓度的等量抗血清，混匀，置37℃孵育直至肉眼可见沉淀物出现。沉淀物的形成量随抗原量的变化而不同，以出现沉淀物最多的最高稀释管为抗原最适比例管。

（2）抗体稀释法：将抗体作一系列倍比稀释，与恒定浓度的抗原等量混合反应，以出现沉淀物最多的最高稀释管为抗体的最适比例管。

（3）棋盘滴定法：又称方阵滴定法。将抗原和抗体进行一系列倍比稀释后，取不同稀释度的抗原抗体等量混合，可一次找出抗原－抗体反应的最适比例（表8－1）。

表8－1　方阵最适比例测定举例

注：“＋”为沉淀量；□为最适比。

3.方法评价　此方法操作简单，设备要求低。但受抗原－抗体比例的影响非常明显，因而常用来作为测定抗原－抗体反应最适比例的方法。

二、免疫浊度测定

免疫浊度测定是将现代光学测量仪器与自动化分析检测系统相结合应用于沉淀反应，可对各种液相介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定的技术。可溶性抗原与相应抗体特异结合，当二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的免疫复合物，使反应液出现浊度变化，反应液浊度与待测抗原量呈正相关，然后利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。

目前，临床常用免疫浊度测定方法有透射比浊法、散射比浊法和免疫胶乳比浊度法三种类型。

（一）透射比浊法

1.基本原理　可溶性抗原与抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物，当光线透过反应液时，由于溶液内免疫复合物微粒对光线的反射和吸收，引起透射光减少，在一定范围内，透射光减少的量（用吸光度表示）与免疫复合物呈正相关，当抗体量固定时，与待测抗原量呈正比（图8－2）。用已知浓度的标准品进行比较，可测出标本中抗原含量。

2.技术要点　取一定量经稀释后的待检样品和标准品分别加入测定管中，分别加入最适工作浓度（用方阵法预先测定）的抗体，孵育一定时间，测定吸光度（A）值。以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘制标准曲线，从标准曲线可得待检抗原量。

3.方法评价　该法敏感度高于单向琼脂扩散5～10倍，但不及标记免疫分析技术高，该法批内、批间重复性较好，操作简便，可全自动化或半自动化分析。反应时间较长，抗原或抗体量过剩时易出现可溶性复合物，造成测定误差。

4.临床应用　透射比浊度法可测定免疫球蛋白、C－反应蛋白、尿微量白蛋白、转铁蛋白等多种抗原、抗体。但因其灵敏度不够高，目前有被散射浊度测定取代的趋势。

（二）散射比浊法

1.基本原理　散射比浊法是一定波长的光沿水平轴通过抗原抗体反应混合液时，由于反应液中免疫复合物微粒对光线的衍射和折射而产生散射光，散射光强度与免疫复合物量成正比，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强（图8－2）。

图8－2　透射比浊法和散射比浊法的工作原理示意图

2.技术要点　散射比浊法可分为终点散射比浊法和速率散射比浊法。

（1）终点散射比浊法：取一定量经稀释后的待测抗原液和抗原标准品分别加入试管中，然后加入抗体充分混匀，孵育一定时间后，用散射比浊仪测定反应液的散射光强度。以抗原标准品的数量为横坐标，浊度为纵坐标，绘制标准曲线。根据待测抗原液的浊度，查出抗原相应含量。

（2）速率散射比浊法：速率比浊法是在抗原－抗体结合过程中，测定二者结合的最大反应速度，即测定单位时间内抗原－抗体反应复合物形成的最快时间段的散射光信号值。该峰值大小与抗原浓度呈正相关。检测时，将经稀释的待检抗原和标准品加入样本盘中，抗血清加入试剂盘，选择检测项目，仪器即可自动测定并计算结果。

3.方法评价　散射比浊法具有速度快、敏感度高（达μg/L水平）、可自动化、精密度和稳定性好等特点。其中速率散射比浊法较终点散射比浊法速度更佳，其敏感度可达ng/L水平。

（三）免疫胶乳比浊度法

免疫胶乳比浊度法是一种带载体的免疫比浊法。上述比浊法中，少量小分子免疫复合物不易形成浊度，为提高免疫浊度测定的灵敏度，建立了该技术。

1.基本原理　致敏胶乳颗粒的抗体（一般直径为0.2μm）与相应抗原相遇时，颗粒表面的抗体与抗原特异性结合，导致胶乳颗粒凝聚。单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，则使透过光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度成正比，即与待测抗原量成正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。

2.技术要点　将抗体致敏胶乳溶液分别和稀释后的待检抗原、不同浓度的抗原标准品反应一定时间后，测定吸光度。然后以抗原标准品的数量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，查出待检抗原量。

3.方法评价　该法精确度和灵敏度都达到了放射免疫测定法要求。但其操作简便，稳定性好，试剂低廉，且所用仪器可与普通分光光度计、自动生化分析仪通用。