凝胶内沉淀试验

单元二　凝胶内沉淀试验

凝胶内沉淀试验（gel phase precipitation）是指可溶性抗原和相应抗体在含电解质的凝胶内自由扩散，扩散过程中抗原和抗体相遇会发生特异性结合，并在比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环，凝胶内沉淀试验又称为凝胶扩散。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶等。根据抗原与抗体反应的方式和特性，凝胶内沉淀试验可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验。

一、单向琼脂扩散试验

1.基本原理　将一定量的已知抗体加入琼脂凝胶中制成琼脂平板，在平板上打孔并加入待测抗原液，待测抗原液在扩散过程中与抗体相遇，在一比例合适的部位，形成以抗原孔为中心的沉淀环，沉淀环的直径与抗原含量成正相关。

2.技术要点　①抗体琼脂板制备：抗体与盐水琼脂混合而成。②制标准曲线：取不同浓度的抗原标准品加入预先打好的孔中，与抗体反应，测定其孔径，绘制标准曲线；③样本检测：加待检标本，测定标本孔的孔径，根据孔径大小在标准曲线中查出相应抗原的量。

3.方法评价　本法稳定、简便，不需仪器设备，重复性和线性较好。但本法灵敏度较差，为1.25mg/L。单向琼脂扩散试验有时可出现双重沉淀环现象，可能是抗原组分不纯或由于抗原性相同但扩散率不同的两个组分所致。

4.临床应用　单向琼脂扩散试验过去被广泛用于各种免疫球蛋白和补体等的定量测定。但由于该法灵敏度低、影响因素多、反应时间长等不足，现临床已不再推荐使用该法来进行定量测定。

二、双向琼脂扩散试验

1.原理　将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，使双方都在琼脂中自由扩散，当抗原和抗体相遇而发生特异性结合时，在比例合适处形成肉眼可见的白色沉淀线。

2.技术要点　①制板：先在平板玻璃上倾注一均匀的琼脂薄层，凝固后在琼脂板上打孔，孔径一般为3mm，孔间距通常在3～5mm，孔的排列可呈梅花形、双排形或三角形等。②检测反应：在相应的孔中加入抗原或抗体，置湿盒37℃培养1～2天，可出现不同沉淀线。

3.方法评价　该法操作简便，无特殊设备，特异性高，结果可靠。但该法灵敏度较低，结果出现晚，不能精确定量，目前临床上已逐渐被其他技术替代。

4.临床应用

（1）检测抗原或抗体：根据沉淀线有无定性；根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量；根据沉淀线的形状判断抗原或抗体的相对扩散速率（图8－3）。

图8－3　沉淀线形状、位置与抗原和抗体扩散速率及浓度的关系

注：A—Ag、Ab浓度及相对分子质量近似；　B—Ag、Ab浓度近似，相对分子质量Ag﹤Ab；

C—浓度近似，相对分子质量Ag﹥Ab；　D—浓度Ag﹥Ab，相对分子质量近似；

E—浓度Ag﹥Ab，相对分子质量Ag﹤Ab；　F—浓度Ag﹤Ab，相对分子质量Ag﹥Ab。

（2）抗原性质的分析　在一块琼脂板上打三个孔，呈三角形排列，其中两孔分别加待测抗原和标准抗原，余一孔加抗体。若两条沉淀线互相吻合相连，表明两种抗原性质完全相同；若两条沉淀线部分相连，说明两种抗原之间有部分相同；若两条沉淀线交叉而过，说明两个抗原完全不同（图8－4）。

图8－4　双向扩散试验不同形态的沉淀线

（3）抗体效价的滴定　按梅花状打孔，中央孔加定量抗原，周边孔加不同稀释度的抗体，以出现沉淀线最高的抗体稀释度为该抗体的效价（图8－5）。

图8－5　抗体效价检测结果示意图

注：中央孔为Ag，周围为Ab，效价为1∶16。

（4）抗原或抗体纯度鉴定　用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，若出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体比较纯，若出现多条沉淀线说明不纯。

三、凝胶内沉淀技术案例

【要求】

能熟练进行单向琼脂扩散试验的操作，正确判断结果。

【用途】

（1）可用于检测血清中IgG、IgM、IgA及补体C3、C4的含量。

（2）为免疫电泳技术奠定基础。

【内容】

单向琼脂扩散试验定量检测IgG。

【相关知识点】

（1）原理：将抗Ig单克隆抗体均匀地混合于琼脂糖凝胶内制成平板，在平板上打孔，并在孔中加入一定量的待测血清，待测样品中Ig呈辐射状向含抗体的琼脂内扩散，当抗原与抗体的量达到恰当比例时形成可见的沉淀环。在一定范围内，沉淀环直径与待检血清中Ig的含量呈正相关。用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg/mL或U/mL）。

（2）应用：本法是一种经典的定量检测技术。因灵敏度不高，只能作初步判断。由于方法简单，可自制反应板进行初步检测。

【准备】

（1）试剂：2%生理盐水琼脂、标准马抗人IgG单克隆抗体、标准参考蛋白、待检血清标本、PBS（pH7.2，0.01M）缓冲液。

（2）器材：打孔器（孔径3mm）及打孔模板、微量加样器、湿盒等。

【操作步骤】

（1）琼脂板的制备：取适量稀释的抗人IgG单克隆抗体于56°C水浴中预热约30min后，倾注于已溶化并维持56～60℃的等量的2%生理盐水琼脂管中，翻转试管1～2次，使抗体与琼脂混合均匀，然后倾注于玻片上，冷却凝固后呈直线排列打孔，孔径一般为3～5 mm，孔距10mm（现已有商品化彩色IgG单扩板）。

（2）标准曲线制备：用生理盐水将标准参考蛋白稀释为五个浓度滴度后，用微量加样器各取10μL依次加入琼脂板的孔中。将加样的琼脂板放湿盒中，37°C孵育24h后，观察结果（图8－6 B排）。

图8－6　单向琼脂扩散试验

以孔中标准参考蛋白质含量为纵坐标，沉淀环直径为横坐标，绘制标准曲线，有如下两种方法。

①Mancini曲线：适用于大分子抗原和长时间扩散（超过48h）的结果处理。在一定范围内，沉淀环随时间延长而逐渐扩大，当抗原抗体反应充分而终止时，沉淀环直径的平方（d²）与抗原浓度（c）呈线性关系，常数K＝c/d²，此为Mancini曲线。Mancini曲线一般使用普通坐标纸绘制曲线。

②Fehcv曲线：适用于小分子抗原和较短时间（24h）扩散的结果处理。抗原浓度的对数（logc）与沉淀环直径（d）呈线性关系，常数K＝logc/d，此为Fehcy曲线。使用半对数坐标纸绘制曲线。

（3）人血清中IgG的测定：取待测血清0.1mL，加生理盐水0.3mL混匀后，用微量加样器取10μL稀释血清加入琼脂板孔中。将加样的琼脂板放湿盒中，37°C孵育24h后，观察并测量沉淀环直径（图8－6A排）。根据沉淀环直径在标准曲线上可查得IgG含量，乘以稀释倍数即为待测血清中的IgG含量。

【注意事项】

（1）在制备标准曲线时，为尽量减少误差，至少应做两份以上标准板。

（2）加样时，每份标本应各加两孔，吸取每份标本均应更换塑料吸头。

（3）制板时，2%生理盐水琼脂温度不宜太高，以免破坏抗体。

【结果判断】

（1）沉淀环的直径大小与抗原含量呈正相关。

（2）测量沉淀环直径，然后用标准曲线算出标本中所含IgG的量（mg/mL）。

【结果分析及临床意义】

正常成人血清IgG的量为12.87±1.35mg/mL，若检测值高于或低于该值均为异常。例如，某些自身免疫病、肝脏疾病等可出现血清IgG增高，而免疫缺陷者可出现IgG降低。