凝胶免疫电泳技术

单元三　凝胶免疫电泳技术

免疫电泳技术（immunoelcctrophoresis technique）是电泳分析与沉淀反应的结合产物，由Graber和Willians于1953年将凝胶扩散置于直流电场中进行而创建。该技术有以下优点：一是加快了沉淀反应的速度；二是电场规定了抗原抗体的扩散方向，提高了灵敏度；三是可将某些蛋白质组分根据其带电荷的不同而将其分开后再与抗体反应，使该技术更为微量化、多样化。免疫电泳技术现已发展为包括免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫固定电泳等多项技术的综合技术手段。

一、免疫电泳和免疫固定电泳

（一）免疫电泳

1.基本原理　免疫电泳技术是区带电泳与免疫双向扩散相结合的一种免疫扩散技术。先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷、相对分子质量和构型不同，在凝胶中电泳分成若干区带，然后沿电泳方向挖一条槽，加入与抗原相对应的抗血清，室温下进行双向免疫扩散，抗原与抗体在琼脂内扩散至比例适合处形成弧形沉淀线（图8－7）。根据沉淀线的数量、位置和形态分析待测样品中所含抗原成分的种类和性质。

2.技术要点　①制备琼脂凝胶板并打孔挖槽；②将待检标本和标准蛋白对照分别加入孔中；③在4～6V/cm的电压下，电泳1.5～2h；④电泳结束后，在槽内加入抗相应抗原的混合抗体，室温下或37℃孵育，直至出现肉眼可见沉淀线；⑤观察沉淀线的数量、位置和形态，并和标准蛋白质与其抗体结合生成的弧形沉淀线进行比较，可分析待测样品中所含蛋白质的种类和性质。

图8－7　免疫电泳示意图

注：槽中加马抗人血清抗体，M表示骨髓瘤患者血清免疫电泳图，N表示正常人血清免疫电泳图。

3.方法评价　该技术操作简单、样品用量少、特异性高、分辨率高。但是由于其影响因素较多，影响其敏感度。

4.临床应用　免疫电泳为定性试验，目前主要应用于纯化抗原和抗体成分的分析及血清免疫球蛋白成分的分析，可识别和鉴定正常、异常免疫球蛋白。例如，多发性骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的M蛋白沉淀弧。

（二）免疫固定电泳

免疫固定电泳是Alper和Johnson建立的，其实质为一项电泳加沉淀反应技术，可用于各种蛋白质的鉴定。

1.基本原理　免疫固定电泳的原理类似于免疫电泳，其不同之处在于，将抗体直接加在电泳后的蛋白质区带表面，或将浸有抗体的薄膜贴于蛋白质区带上，抗原和抗体被固定。通过漂洗、染色，脱色、干燥后，即可进行鉴定。

2.技术要点　①区带电泳：先将患者血清或血浆在醋酸纤维膜或琼脂上作区带电泳（6孔），根据血清蛋白质的电荷不同将其分开。②加抗血清：将IgG、IgA、IgM、IgE、IgD的κ轻链和λ轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道上，参考泳道加抗正常人全血清用于区带对照。③反应、漂洗、染色：作用30min后，洗去游离蛋白质，待干燥后用氨基黑染色。④脱色、干燥后判断结果，被检蛋白抗原被固定，形成窄而致密的沉淀带。

3.方法评价　免疫固定电泳最大的优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析，目前已作为常规检测，应用于半自动、全自动电泳分析仪上。

4.临床应用　本法可用于免疫球蛋白异常增殖的检测，如血清M蛋白、轻链蛋白和尿液轻链蛋白的定性、定量检测。

二、对流免疫电泳

1.基本原理　对流免疫电泳是双向免疫扩散与定向加速电泳相结合的一种免疫扩散技术。在pH值为8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分常带较强的负电荷，在电场中向正极移动；而抗体球蛋白因其等电点偏高（pH值为6～7），带负电荷少，且分子较大，故电泳力小，同时，凝胶的电渗作用较大，使其向负极移动。因此对流免疫电泳将抗原放负极侧孔，抗体则放正极侧孔，在电场中二者相向移动而迅速相遇结合，在比例适宜处形成沉淀线。若抗原浓度超过抗体，沉淀线靠近抗体孔（图8－8）。

2.技术要点　①制备琼脂凝胶板并在琼脂板上打两排孔；②将待检标本和阳性抗原对照分别加入阴极侧孔中，阳极侧孔加相应抗体；③在3～4mA/cm的条件下，电泳30min后观察结果。

图8－8　对流免疫电泳示意图

3.方法评价　本试验简便、快速，灵敏度比双向免疫扩散法高8～16倍，可测出蛋白质的浓度达μg/mL。但分辨率低于双向免疫扩散试验。

三、火箭免疫电泳

火箭免疫电泳实质上是通过电泳进行加速的单向免疫扩散试验，由于其沉淀形似火箭，故称为火箭免疫电泳。

1.基本原理　抗原与相应抗体结合，在比例合适时生成不溶性免疫复合物。在电场作用下，抗原在琼脂凝胶内扩散而产生浓度梯度，随着抗原量的逐渐递减，与凝胶内抗体结合生成的不溶性免疫复合物也减少，致使沉淀带越来越窄，形成火箭样的沉淀带。峰形的高低与抗原量呈正比（图8－9）。

2.技术要点　将抗体混合于琼脂中制成抗体琼脂凝胶板，在板的一侧打孔，孔径3 mm，孔距2mm，然后置琼脂板于电泳槽内，其中样品孔位于负极端。在样品孔中用微量注射器准确加样10μL，3～5mA/cm电泳6h，观察沉淀峰并测量从孔中心到峰尖的高度。根据标准曲线求出待测样品中抗原含量。

图8－9　火箭免疫电泳示意图

注：①②③④为标准抗原，⑤⑥为待检抗原。

3.方法评价　该法操作简便省时，重复性好，灵敏度高，定量检测抗原可达μg/mL以上的含量，若采用放射性核素标记作免疫自显影，可测出达ng/mL的抗原浓度。

4.临床应用　该技术可用于抗原蛋白定量检测，如IgA、IgG、IgM、sIgA、C3、C4及其裂解产物和AFP等的测定。

（徐勇杰）

重点提示

1.沉淀反应与凝集反应区别（表8－2）

表8－2　沉淀反应与凝集反应区别

2.沉淀反应的应用　沉淀反应和凝集反应是免疫学的经典基础技术，为免疫技术的发展和新型免疫测定技术的设计奠定了基础。但因影响因素较多，灵敏度较低，在定量检测方面的应用价值降低，现临床上多用快速、敏感的新型技术所替代。

3.单向扩散试验平板法的特点　这是一种定量的凝胶内沉淀试验。通过测量沉淀环的直径而得出抗原量。单向扩散试验中应注意抗血清的质量和抗原性相同但扩散率不同的两个组分对试验结果的影响，学会对试验中假阳性、假阴性结果的分析。双向扩散试验平板法是鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一，它可以应用于：抗原或抗体的定性；抗原或抗体相对分子质量的分析；抗原性质的分析；抗体效价的滴定；抗原或抗体纯度鉴定。

4.免疫电泳技术的特点　免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物，常见的有对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等。①对流免疫电泳是双向免疫扩散与电泳相结合的免疫扩散技术，相对应的抗原抗体在电场作用下相对移动形成沉淀线，可定性检测；从沉淀线位于两孔间的位置可大致判断抗原抗体的比例关系；②火箭免疫电泳是将单向免疫扩散与电泳相结合的一项定量检测技术，电泳时抗体不移动，抗原向正极泳动，最后形成火箭状的沉淀峰，峰的高度与抗原量呈正相关；③免疫电泳是区带电泳与免疫双扩散相结合的一种免疫分析技术，根据沉淀线的数量、位置和形态可分析待测样品中所含成分的种类和性质，但免疫电泳沉淀线的数目和分辨率受许多因素影响；④免疫固定电泳是具有实用价值的电泳加沉淀反应技术，该方法原理类似免疫电泳，临床上最常用于M蛋白的鉴定。

目标检测

一、单项选择题

1.单向琼脂扩散试验，抗体与融化琼脂混合的温度是（　　）。

A.约37℃　　B.约45℃　　C.约50℃　　D.约60℃　　E.室温

2.单向琼脂扩散法可用于（　　）。

A.抗体定性　　B.抗体定量　　　　C.抗原定性

D.抗原定量　　E.抗体效价滴定

3.双向琼脂扩散试验出现多条沉淀线的原因（　　）。

A.抗原抗体过剩　　B.抗原抗体相等　　　　C.抗原抗体缺乏

D.抗原抗体不纯　　E.抗原抗体相对分子质量不等

4.双向琼脂扩散试验测量两种有相关成分的抗原时，沉淀线出现（　　）。

A.二条直线相交叉　　B.二条弧线完全融合　　C.二条弧线部分融合

D.二条弧线不连接　　E.二条相交弧线靠近抗体孔

5.双向琼脂扩散试验中，抗原含量较大，反应沉淀线应（　　）。

A.靠近抗原孔　　　　　B.靠近抗体孔　　　　C.在两孔之间

D.沉淀线弯向抗原孔　　E.呈多条沉淀线

6.速率散射比浊法测定的散射信号值产生于（　　）。

A.单位时间内最大量的免疫复合物

B.单位时间内免疫复合物形成的最快时间段

C.单位时间内免疫复合物形成的最稳定期

D.抗体过剩期形成的免疫复合物

E.小分子不溶性免疫复合物颗粒

7.对于血清中数种蛋白质抗原成分的分析，常用（　　）。

A.免疫电泳法　　　　B.双向扩散试验　　　　C.单向扩散试验

D.火箭免疫电泳　　　E.对流免疫电泳

8.免疫电泳是（　　）。

A.区带电泳与双向免疫扩散相结合的技术

B.电泳与单向免疫扩散相结合的技术

C.电泳与双向免疫扩散相结合的技术

D.区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术

E.电泳与环状沉淀反应相结合的技术

9.免疫电泳法常用于（　　）。

A.IgG定量测定　　　　　　B.抗原组分鉴定　　　　C.IgG类别鉴定

D.抗原相对分子质量测定　 E.抗体效价测定

10.免疫电泳的结果，主要是观察（　　　）。

A.沉淀环的直径　　　　　　　　B.沉淀弧的长短　　　　C.沉淀峰的高低

D.沉淀线的数目、形状和位置　　E.沉淀弧的方向

二、简答题

1.决定抗原和抗体最佳配比的方法有几种？

2.免疫浊度测定的反应体系中，为什么必须始终保持抗体过量？

3.如何检测本周蛋白（自学相关书籍）？

4.谈谈你对自动化免疫电泳的认识（自学相关书籍）。