金免疫分析技术

单元六　金免疫分析技术

单元学习目标

1.掌握斑点金免疫渗滤试验的原理、操作方法、结果判断和临床应用。

2.熟悉金免疫技术的分类。免疫胶体金的制备流程。

3.了解斑点金免疫色谱试验的原理。

金免疫分析技术又称免疫胶体金技术，是一种以胶体金作为标记物的标记免疫技术，由Faulk和Taylor始创于20世纪70年代初期。

一、胶体金与免疫金制备

胶体金也称金溶胶，是金盐被还原成原子金后，形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC1－₂），外层离子层H＋则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。

（一）胶体金的制备

1.制备原理　胶体金的制备一般采用还原法。在一定浓度的金盐溶液内加入一定量的还原剂使金离子还原成金原子，形成金颗粒悬液。常用的金盐是氯金酸HAuCl₄，还原剂有枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。

2.制备方法　枸橼酸盐还原法最为常用，其制备技术要点如下：取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1%枸橼酸三钠水溶液（Na₃C₆H5O₇·2H2O）0.7mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色，继续煮沸15min，冷却后以蒸馏水恢复到原体积，可获得71.5nm大小的胶体金颗粒。通过改变枸橼酸钠的用量可以制备16～147nm大小的胶体金颗粒（表9－7）。

表9－7　常见粒径胶体金的制备

※还原100mL　0.01%氯金酸溶液所需量。

3.注意事项

（1）玻璃容器的清洁　胶体金的制备过程中使用的所有玻璃容器应保持绝对清洁，因玻璃容器表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成，所以玻璃容器使用前必须经过酸洗和硅化。一般硅化过程是用5%二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器1min，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，再干燥备用。如果是专用的清洁器皿，可以用第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后用双蒸馏水淋洗，通过这样的操作来代替硅化处理。

（2）试剂、水质和环境　氯金酸吸潮性很强，对金属有很强的腐蚀性，使用时不能用金属药匙，同时要避免接触天平秤盘。实验用水一般用双蒸馏水，实验室要尽量无尘，否则实验结果的重复性差。为了保持溶液稳定的pH值，应选用缓冲容量大的缓冲系统，一般为pH值3.0～5.8的柠檬酸磷酸盐、pH值5.8～8.3的Tris－HCL和pH值8.5～10.3的硼酸氢氧化钠等缓冲系统，但应注意控制缓冲液浓度，若浓度过高可使金溶胶自凝。

4.质量鉴定　①外观检查：良好的胶体金应为清亮透明悬液，若混浊或表面有漂浮物，提示胶体金有凝集颗粒；②颗粒大小与均一性检查：肉眼观察比较胶体金颜色，初步估计颗粒大小，或用分光光度计扫描λ_max估计粒径，或用电镜，比较精确测定平均粒径。

5.胶体金保存　制备好的颗粒装入洁净玻璃器皿中，放入少量防腐剂（0.02%NaN₃），小量分装备用，防止细菌污染和凝集颗粒形成。使用时若有少量凝集颗粒可低速离心去除后再用于标记。

（二）免疫金制备

胶体金可以和抗原或抗体等大分子物质结合形成胶体金结合物，在免疫测定中，将这类结合物称为免疫金或胶体金标志物，而在免疫组织化学技术中，则称为金探针。

1.制备原理　免疫金制备的基本原理是将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。目前对吸附的机制尚不清楚，一般认为与物理吸附有关。胶体金颗粒表面带负电荷，与蛋白质表面的正电荷通过静电引力相互吸引，达到范得华引力范围内即形成牢固结合。因此环境pH值和离子强度是影响吸附的主要因素。其他如胶体金颗粒的大小及粗糙表面、蛋白质的相对分子质量大小、浓度等，也会影响蛋白质的吸附。

2.技术要点

（1）胶体金溶液pH值的调配　胶体金对蛋白质的吸附主要取决于pH值，用0.2 mol/L K₂CO₃或0.1mol/LHC1调整胶体金溶液的pH值至标记蛋白质的等电点或稍偏碱。通常需经多次试验才能确定最适反应pH值。调节pH值时应注意，不可以直接将电极插入胶体金溶液中，因胶体金会阻塞pH计的电极，宜先用浓度为0.1%的聚乙二醇稳定胶体金后，再行测定。

（2）蛋白质最适用量的确定　将待标记蛋白质作系列稀释后，分别取0.1mL蛋白质稀释液加入1mL胶体金溶液中，并设一管不加蛋白质的对照管，然后加入10%NaCl溶液0.1mL混匀、静置2h。若蛋白质含量少，不能稳定胶体金，管溶液颜色由红变蓝；若蛋白质含量达到或超过最低稳定量，管溶液则保持红色不变，以红色不变管中蛋白质含量最低管的浓度即为稳定1mL胶体金所必需蛋白质的量。在此基础上再增加10%～20%就可作为待标记蛋白质的实际用量。因蛋白质溶液含盐量较高或形成聚合物时易影响标记过程，故标记前常将蛋白质溶液用低浓度的盐水透析数小时并高速离心除去聚合物。

（3）胶体金标记　按最适用量比例，在电磁搅拌下将所需要量的胶体金加入至一定量的蛋白质溶液中，反应一定时间后加入一定量的稳定剂（如BSA或PEG20000），以防止胶体金和蛋白质聚合和发生沉淀，调整pH值至8.5，继续反应数分钟后离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。不同粒径的胶体金颗粒其离心条件不同，一般为5nm金颗粒用40000r/min的离心速度离心60min；8nm金颗粒用25000r/min的离心速度离心45 min；14nm金颗粒用25000r/min的离心速度离心30min；40nm金颗粒用15000r/min的离心速度离心30min。离心后轻吸上清液，将沉淀用含稳定剂的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此反复2～4次后，取沉淀物溶解即可获胶体金结合物的初提物。

（4）胶体金结合物的纯化与鉴定　胶体金结合物（免疫金）的纯化主要有超速离心法和凝胶过滤法；鉴定包括电镜测定颗粒的平均直径以及免疫组化滤纸模型测定结合物的特异性、敏感性。

（5）保存　免疫金最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液是含有稳定剂的中性PBS或Tris缓冲液。常用的稳定剂有PEG2000、BSA、葡聚糖、明胶等，以保护胶体金的分散悬浮稳定性和防止或减少免疫金的非特异性吸附反应。

二、金免疫测定技术

金免疫测定技术是以微孔膜作为固相载体，应用胶体金标记抗原（抗体），定性或半定量检测待测标本中的抗体（抗原）的一种快速的标记免疫技术。根据液体在微孔膜上流动方式的不同建立了两种金免疫测定技术，即穿流形式的斑点金免疫渗滤试验和横流形式的斑点金免疫层析试验。

（一）斑点金免疫渗滤试验

1.原理　斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA）是将抗原或抗体点加在具有过滤性能的固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上。待测的标本液体渗透滤过膜时，标本中抗原或抗体被膜上抗体或抗原捕获，其余无关蛋白质等则随液体滤出，其后加入的胶体金标记物也在渗滤中与相应的抗体或抗原相结合而被聚集在膜上。因胶体金呈红色，阳性反应结果即为膜上呈现红色斑点。液体通过微孔滤膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目的（一般在5min左右完成），同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到洗涤目的，简化了操作步骤，因此斑点金免疫渗滤试验已成为床旁检验主要方法之一。本方法除试验盒本身外，不需要任何仪器设备。

2.技术类型

（1）双抗体夹心法测抗原　将抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，若标本中待测抗原与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性标本即在膜中央呈红色斑点。

（2）间接法测特异性抗体　用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰，易导致假阳性结果，临床上较少用。

（二）斑点金层析试验

斑点金层析试验（dot immunogold chromatograpHic assay，DICA）是以微孔滤膜为载体，将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的快速固相膜免疫分析技术，也称斑点免疫层析试验。

1.原理　斑点金层析试验与斑点金免疫渗滤试验的原理基本相同，不同的是液体移动不再是直向的穿流，而是基于层析作用的横流。DICA将各种反应试剂分点固定在一试纸条上，试纸条由上到下依次是吸水材料、硝酸纤维素薄膜条、含有小鼠IgG的免疫金复合物干片、吸水材料，其中硝酸纤维素薄膜条依次包含参照区和测试区两个反应区域，参照区包被的是抗小鼠IgG，测试区包被的是特异性抗体。待检标本滴加在试纸条的一端后，样品中的抗原受载体膜的毛细管作用向另一端泳动，类似层析作用，与试纸条上的试剂发生特异性结合，形成的免疫复合物固定在层析试剂条的特定区域，通过免疫金显色来判断结果。

2.技术要点　斑点金层析试验多用于抗原检测，常用的方法是双抗体夹心法。如图9－18所示，由多个试剂组合在一试纸条上，C区为金标抗体（免疫金），T区包被特异抗体，R区包被抗金标抗体，B区和A区为吸水材料。测定时将试纸条A端浸入待测标本中，A端吸水材料即吸取液体向B区移动，流经C区时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测特异抗原，可与免疫金中的抗体结合，形成金标抗体－抗原复合物，此抗原抗体复合物流至T区时，被此区包被的固相抗体捕获，形成金标抗体－抗原－抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示出红色反应线条（T）。过剩的免疫金继续前行，至R区时被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条。若呈现红色反应线条和红色质控线条，试验为阳性。若仅显示红色质控线条，则为阴性。

图9－18　免疫层析试验双抗体夹心法测抗原

斑点金层析试验还有间接法和竞争法两种技术类型。间接法常用于测定抗体，结果判断同夹心法。竞争法用于测抗原，与夹心法不同处是T区包被已知特异抗原，故金标抗体与待测对应抗原结合后，无多余金标抗体与T区抗原结合，故显示红色质控线条，T区无显色反应为阳性，如T区、R区同时出现红色线条为阴性。

（三）临床应用及评价

金免疫测定技术较其他标记免疫技术具有快速简便、单份测定、无仪器设备需要、试剂和样品用量极少，以及操作人员不需技术培训等特点，因此特别适用于“床边检验”或“家用试验”以及临床急诊检验。但该技术的灵敏度不及酶免疫测定，且不能准确定量，只能进行定性或半定量检测，目前主要限于检测正常体液中不存在的物质（如诊断传染病中的抗原或抗体以及毒品类药物等）和正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质（如HCG等）。目前临床检验中已开展的金免疫检测项目有：检测HCG、AFP、轮状病毒、A族链球菌、衣原体等抗原，也可用于抗HCV、抗HIV、抗弓形虫、抗巨细胞病毒等抗体的测定，在急诊检测肌酸激酶同工酶、肌红蛋白等对心肌梗死的诊断具有重要意义。

三、金免疫测定技术案例

（一）检测肺炎支原体IgM抗体

【要求】

（1）熟悉斑点金免疫渗滤试验的检测原理。

（2）学会斑点金免疫渗滤试验的操作并作出正确结果判断，规范出具报告。

（3）知晓肺炎支原体IgM抗体检测的临床意义。

【用途】

定性检测人血清中的肺炎支原体IgM抗体，早期辅助诊断肺炎支原体感染。

【内容】

斑点金免疫渗滤试验检测肺炎支原体IgM抗体。

【相关知识点】

（1）检测原理：试剂盒里的斑点反应板上的微孔滤膜固相有肺炎支原体P₁蛋白抗原斑点，当待检测的血清中含有肺炎支原体IgM抗体时，与微孔滤膜上的肺炎支原体P₁蛋白抗原形成复合物，胶体金标记的羊抗人IgM抗体与上述抗原抗体复合物结合，形成肉眼可见的红色圆斑点，即为阳性结果，否则为阴性结果。

（2）属于斑点金免疫渗滤试验间接法。

【准备】

（1）试剂盒组成：斑点金免疫渗滤试验的试剂盒主要由四部分组成：①胶体金反应板：由吸水垫、点加了抗原的硝酸纤维素膜片、塑料小盒组成；②洗涤液（试剂A）；③胶体金标记物（试剂B）；④抗体阳性、阴性对照品。

（2）试剂盒放在4℃下储存备用。

【操作步骤】

（1）将待测血清样本和试剂盒恢复至室温。

（2）取出反应板，于反应板孔中滴入试剂A两滴，静置至试剂A完全吸入。

（3）用加液器吸取待测血清样本100μL于反应板孔中，静置至血清完全吸入。

（4）取下反应板上的蓝色耳盖，滴入试剂B三滴，静置至试剂B完全吸入。

（5）再滴入试剂A两滴，静置至试剂A完全吸入，在5min内观察反应板孔中现象。

（6）试验同时做阳性、阴性对照。

【注意事项】

（1）试剂盒须低温保存，平衡至室温使用。

（2）血清标本中非目的IgM的干扰，易导致假阳性结果，注意结果分析判断。

【结果判断】

呈现肉眼可见的红色圆斑点为阳性结果，否则为阴性结果。

【结果分析及意义】

（1）阳性结果表示受检者血清中有肺炎支原体IgM阳性。

（2）感染初期，IgM未产生或滴度很低会导致假阴性结果，应提示患者在7～14天内复查，复查时同时平行检测上次采集的标本，以确认是否出现血清学阳性或滴度是否明显升高。

（3）IgM抗体阳性不仅发生在原发感染，在继发感染亦可见IgM反应。确认肺炎支原体感染需同时结合患者的临床表现或进一步结合其他方法来进行判断。

（二）检测绒毛膜促性腺激素（HCG）

【要求】

（1）熟悉斑点金层析试验的检测原理。

（2）学会斑点金层析试验操作并作出正确结果判断，规范出具报告。

【用途】

（1）检测尿液中人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），用于早期妊娠的诊断。

（2）用于卵巢、子宫肿瘤辅助诊断。

【内容】

斑点金层析试验检测HCG。

【相关知识点】

（1）反应类型：采用斑点金免疫层析（DICA）技术双抗体夹心法，以胶体金为指示标记，检测尿液中人绒毛膜促性腺激素HCG浓度，来确诊被检者是否怀孕，是协助临床判定妊娠的可靠指标。

（2）反应流程：

结果：测试区、参照区显示红色线条为阳性。测试区无反应线条而仅显示质控线条为阴性。

【准备】

待检尿液、早早孕HCG胶体金试纸条。

【操作步骤】

将早早孕HCG胶体金试纸条标有“MAX”一端浸入待检尿液中，保证“MAX”标记线在液面以上，3s后取出试纸条平放，1～3min内观察实验结果，最长不超过5min。

【注意事项】

（1）检测时要注意尿液浸没试纸条的长度和时间，尿液浸没检测试纸条的长度过长或时间过久可能使测试结果难以判断。

（2）观察结果时间不得超过5min，否则影响结果判定。

（3）试纸条虽然可在室温保存，但为避免抗体失效，大批试纸条应放4℃下保存。

（4）从冰箱刚取出的试纸条应待其恢复至室温后打开，避免反应线模糊不清。

【结果判断】

试纸条出现双红线为阳性结果；出现单红线为阴性结果；未出现任何红线说明试剂失效。

【结果分析及临床意义】

（1）阳性结果表示受检者尿中HCG阳性；阴性则说明尿中无HCG。

（2）口服绒毛膜促性腺激素药物可导致出现阳性结果；子宫内膜增生、绒毛膜癌、葡萄胎、支气管癌或肾癌病人，因尿中HCG含量较高，可能会出现阳性结果；人工流产以及分娩后的7～14天内进行检测也会出现阳性结果。

（池　明）

重点提示

1.概念理解　金免疫分析技术是一种以胶体金作为标记物的新型免疫标记技术，其原理与酶标、放免等免疫标记技术类似。

2.应用价值　金免疫分析技术具有快速简便、单份测定、无仪器设备需要，试剂和样品用量极少，操作人员不需专门技术培训等特点，主要用于定性检查，床旁或家庭检查。

3.技术类型　金免疫分析技术分为金免疫测定技术和金免疫组织化学技术。前者可用于游离抗原或抗体检测，后者可用于组织中抗原的检测与定位，检测细胞悬液或单层培养细胞的膜表面抗原和胞内抗原。其技术类型如下：

4.胶体金制备　常用枸橼酸盐还原法将金盐还原成原子金后所形成的金颗粒悬液即胶体金，枸橼酸盐的用量与形成金颗粒的大小有关，pH值、水质是胶体金制备质量主要影响因素。胶体金的颜色与金颗粒大小、光吸收波长有关，见表9－8。

表9－8　胶体金大小与光吸收性

5.免疫金制备　免疫金是吸附有抗原或抗体的胶体金，通过胶体金表面负电荷引力吸附抗原或抗体，环境pH值和离子强度是影响吸附的主要因素。免疫金制备流程包括胶体金溶液pH值的调配；被标记物（如蛋白质）最适用量的确定；胶体金标记；免疫金纯化、鉴定与保存。

目标检测

一、单项选择题

1.在免疫金的制备原理中，胶体金与蛋白质结合力为（　　）。

A.肽键结合力　　B.二硫键结合力　　　C.氢键结合力

D.静电引力　　　E.疏水作用力

2.金免疫层析试验双抗体夹心法测b抗原，层析条的结果判读处应包被（　　）。

A.金标记抗b抗体　　B.抗b抗体　　　C.抗免疫金抗体

D.标准抗原（b）　　E.人血清IgG

3.用于斑点金免疫层析试验双抗体夹心法载体膜质控线处包被的物质是（　　）。

A.抗免疫金抗体　　　B.人白蛋白　　　C.待测抗原标准品

D.胶体金标记抗体　　E.胶体金颗粒

4.关于斑点金免疫层析试验双抗体夹心法结果判读正确的是（　　）。

A.仅出现一条棕红色质控条带者为试验结果阳性

B.出现两条棕红色质控条带者为试验结果阳性

C.未出现棕红色质控条带者为试剂失效

D.必须在5min内观察结果

E.仅在试验区出现一条棕红色质控条带者为试验结果阳性

5.关于斑点金免疫渗滤和免疫层析实验操作，二者相同的是（　　）。

A.二者均需要胶体金标记物、洗涤液等溶液试剂

B.所有反应都是在固相膜的一个固定区域完成

C.反应结果的判断，二者均不需酶促底物反应呈色

D.所有试剂均预制在膜上

E.两者结果判读模式一样

6.下列关于斑点金固相膜免疫测定的说法正确的是（　　）。

A.可以适用于定性和定量试验

B.其标记物是胶体金颗粒

C.免疫渗滤试验是利用了微孔膜的毛细管作用

D.免疫层析试验是利用了微孔膜的穿流性

E.方法具有简便、快速、灵敏度较高的特点

二、简答题

1.简述免疫金的制备过程。

2.简述胶体金的一般性状。（自学后回答）