肿瘤细胞分离鉴定

单元一　免疫细胞的分离

免疫细胞准确检测的基础是细胞的分离、纯化。目前分离细胞的方法很多，它们主要是根据细胞的大小、密度、黏附性和吞噬功能的不同以及表面标志的不同而设计的。但究竟采用何种方法，应根据实验目的以及拟分离细胞的种类、数量和纯度等方面来确定。

一、外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）是指以淋巴细胞和单核细胞为主的免疫细胞混合体。它是免疫学实验中最常用的细胞材料，也是T细胞、B细胞分离纯化的细胞来源。人PBMC主要从外周血中分离获得。外周血中红细胞和多核白细胞相对密度较大，分别为1.093和1.092，而淋巴细胞和单核细胞相对密度为1.075～1.090，血小板的为1.030～1.035。因此，利用不同密度的液体作为分层液进行密度梯度离心，可使不同密度的血细胞按相应密度梯度分层排列，从而被分离。常用的分层液是相对密度为1.077的Ficoll－Hypaque液，有时也用Percoll液。

（一）Ficoll分离法

1.原理　Ficoll分离法是利用聚蔗糖－泛影葡胺（Ficoll－Hypaque）作为分层液分离单个核细胞的一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺分层液的主要成分是聚蔗糖（商品名为Ficoll），相对分子质量为40kD，其密度高、渗透压低且无毒性。高浓度的Ficoll溶液黏性高，易使细胞聚集，故常用6%Ficoll溶液，其相对密度为1.020。相对密度为1.200的泛影葡胺可增加溶液密度，因此在Ficoll溶液中加入不同量的浓度为34%的泛影葡胺即可配制成不同密度的分层液。分离人PBMC以相对密度为（1.077±0.001）的分层液为最佳。

2.技术要点　将配制的相对密度为（1.077±0.001）的Ficoll－Hypaque分层液加入试管底层，肝素抗凝静脉血用Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平离心，红细胞和粒细胞因其密度大于分层液，同时因红细胞遇Ficoll液凝集成串而沉积于管底，血小板则因密度小而悬浮于血浆中，单个核细胞因与分层液密度相当而密集在血浆层和分层液的界面间，呈白膜状（图10－1）。吸取该层细胞，洗涤离心，计数。活细胞率在95%以上为佳。

3.方法评价　本法是分离单个核细胞最常用的方法。本法的细胞获得率可达80%以上，但获得率高低与室温有关，若室温超过25℃会影响细胞获得率。单个核细胞纯度可达95%，其中淋巴细胞占60%～70%。

（二）Percoll分离法

1.原理　Percoll分离法是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是经聚乙烯吡喀烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性。Percoll液中的硅胶颗粒大小不一，经高速离心后形成一个连续密度梯度，从而将不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带而分离。

2.技术要点　首先将Percoll原液（相对密度为1.135）与等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，然后将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心，可产生四个细胞层（图10－1）。表层为死亡细胞和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层为单核细胞，下层为淋巴细胞。

图10－1　单个核细胞分离效果示意图

3.评价　该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一种较好方法，且对细胞活性没有影响。单核细胞纯度达78%，淋巴细胞纯度达98%。但本法操作流程较长，步骤较多，需要一定的设备条件。

二、淋巴细胞及其亚群的分离

（一）淋巴细胞的分离

密度梯度离心法获得的PBMC悬液的主要成分是淋巴细胞，但还有数量不等的单核细胞以及少量红细胞，因此为了获取高纯度的淋巴细胞应去除单核细胞和红细胞。

1.红细胞的去除

（1）低渗裂解法：在PBMC悬液中加入一定量的无菌蒸馏水，红细胞在低渗液中肿胀溶解。随后加入相同量的1.8%的NaCl溶液恢复为等渗即可。

（2）氯化铵裂解法：在PBMC悬液中加入一定量的0.83%氯化铵溶液即可裂解红细胞。

2.单核细胞的去除

（1）黏附法：在37℃和Ca^2＋存在条件下，单核细胞可发挥黏附玻璃、塑料、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性。将PBMC悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞粘贴于平皿壁上，而未黏附的细胞即为淋巴细胞。亦可用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10层析柱进行黏附，具有黏附能力的细胞被吸附而位于柱中，淋巴细胞则位于洗脱液中。此法简便易行，对细胞损伤极少，但缺点是会损失部分B细胞，因B细胞也有弱黏附性。此法的细胞回收率和纯度会受静置时间的影响。

（2）羰基铁吞噬法（磁铁吸引法）：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加入直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内，不时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，将磁铁放置在管底外，单核细胞将被吸引而滞于管底，上层液中即为较纯的淋巴细胞。若用羰基铁粉，则采取聚蔗糖－泛影葡胺分层液密度梯度离心，单核细胞因吞噬羰基铁粉密度增大而沉积于管底。

（3）苯丙氨酸甲酯去除法：苯丙氨酸甲酯（phenylalanine methyl ester，PME）具有亲溶酶体性质，在溶酶体内可被水解为氨基酸，导致溶酶体渗透压升高而破裂，破裂的溶酶体释放出的酶可引起自身细胞溶解。故用该法可溶解清除含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞等，B细胞和大多数T细胞则不受影响。该法去除单核细胞后，悬液中约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性达95%以上。

（二）T淋巴细胞、B淋巴细胞及其亚群的分离

淋巴细胞是一群不均一的细胞群体，其中包括许多形态相似而表面标志和功能各异的细胞群和亚群。根据淋巴细胞群及其亚群的表面标志或生物学特性差异而建立以下分离方法。

1.E花环沉降法

（1）原理：成熟T细胞表面具有独特的绵羊红细胞（SRBC）受体即E受体或CD2，其可以结合SRBC，形成玫瑰花环样细胞团（彩图20）。通过密度梯度离心，形成E花环的T细胞位于管底，未形成E花环的B细胞则在分层液界面，从而实现分离。然后用低渗液裂解SRBC，即可得到纯化的T细胞。

（2）技术要点：将稀释的PBMC悬液与一定比例的绵羊红细胞混合，待E花环形成后，用聚蔗糖－泛影葡胺分层液进行密度梯度离心。E花环形成细胞密度增大而沉于管底；浮悬在分层液界面的是未形成E花环的细胞群，其富含B细胞。用低渗法裂解花环中的绵羊红细胞，则获得纯的T细胞。若预先用神经氨酸酶和2－氨乙基硫脲溴化物处理绵羊红细胞，则可增加花环的形成效果和稳定性，提高T细胞的分离效率。

（3）方法评价：该方法简便易操作，主要分离T细胞，获取的T细胞纯度可达95%～99%。但SRBC与T细胞结合时可引起T细胞活化。

2.尼龙棉黏附法

（1）原理：根据B细胞能够黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞不能黏附的特性，可将T细胞和B细胞分离。

（2）技术要点：取松散而经过处理的尼龙棉，均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管内，制成尼龙棉柱，并经Hanks液浸泡平衡；将PBMC悬液加入柱内，37℃温箱静置1～2h；用预热的含10%～20%小牛血清培养液灌洗尼龙棉柱，非黏附性的T细胞被冲洗在洗脱液中；重复灌洗几次，尽可能将管内的T细胞完全分出；再用培养液边冲洗边挤压塑料管，此时洗脱液内则富含B细胞。

（3）方法评价：该法操作简单快速，不需特殊设备，也不影响细胞活性，所获得的T细胞纯度在90%以上，B细胞纯度可达80%，是实验室常用的分离方法之一。

3.免疫吸附分离法

（1）原理：利用淋巴细胞亚群具有不同的表面抗原的特点，将相应的单克隆抗体包被于反应板上，再加入细胞悬液，抗原阳性细胞与相应抗体结合而被吸附在反应板上，抗原阴性的细胞则留在细胞悬液中。

（2）技术要点：①用已知的单克隆抗体包被聚苯乙烯反应板；②加入待分离的淋巴细胞悬液，抗原阳性的细胞吸附于反应板上，抗原阴性的细胞则存在于未吸附的细胞悬液中；③从反应板上洗脱、收集抗原阳性细胞，从未吸附的细胞悬液中可获取抗原阴性细胞。

（3）方法评价：该方法适用于T细胞和B细胞以及T细胞亚群即CD4^＋或CD8^＋的分离。由于本法可同时进行细胞的阳性和阴性选择，获取的细胞量大。但对固定于反应板上的细胞进行分离时，可能损伤细胞，降低活性。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体结合后，可引起细胞激活。因此，免疫吸附分离法更适用于阴性选择，即去除细胞悬液内某一细胞亚群。

4.免疫磁珠分离法

（1）原理：磁珠是一种以金属离子为核心、外层均匀包裹高分子材料的固相颗粒，具有磁性，并可结合不同的生物大分子物质。将某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠。当特异性单抗与表达相应抗原的靶细胞结合后，利用磁场可以将免疫磁珠所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。

（2）技术要点：免疫磁珠分离细胞具有阳性和阴性选择两种方法。直接分离获取磁珠结合细胞为阳性选择，阴性选择则是上清液中的未结合细胞为获取细胞（图10－2）。

图10－2　免疫磁珠分离法示意图

（3）方法评价：免疫磁珠分离法的优点是分离纯度高，达93%～99%；重复性好；分离细胞总量大，达90%以上；该法分离效果可与流式细胞术媲美，且比后者操作简便、快速，无特殊设备要求。但阳性选择细胞时，抗体可引起细胞活化或凋亡。

5.流式细胞术分离法

流式细胞术分离法是先进的细胞分离方法，其详细原理和技术要点见本任务单元三。

三、其他免疫细胞的分离

（一）单核－巨噬细胞的分离

密度梯度离心法获取的外周血单个核细胞悬液中大约有40%是单核细胞和巨噬细胞。分离单核－巨噬细胞的方法主要有：①Pecoll密度梯度分离法；②流式细胞术分离法；③免疫磁珠分离法；④黏附法。其中，黏附法会影响单核－巨噬细胞的功能甚至损伤单核－巨噬细胞，不适用于单核－巨噬细胞生物学活性的研究试验，适于祛除单核－巨噬细胞。前三种方法均不影响单核－巨噬细胞活性，但流式细胞术分离法设备要求高，操作复杂；Pecoll密度梯度分离法获取细胞数量较少，用血量多；目前较常用的是免疫磁珠分离法。

免疫磁珠分离法分离单核－巨噬细胞是利用单核－巨噬细胞特异性表达CD14的特征，用抗CD14的单克隆抗体包被磁性微球形成CD14＋免疫磁珠，利用该免疫磁珠与待分离的PBMC反应，表达CD14的单核细胞结合在磁珠上，其他细胞则不能结合。然后通过磁场作用实现单核细胞与其他细胞的分离。

（二）中性粒细胞的分离

从血液中分离中性粒细胞的常规方法是采用右旋糖酐沉降法。由于红细胞、白细胞相对密度不同，导致它们的沉降速度不同，同时右旋糖酐能将红细胞凝聚成串使其快速沉降，而白细胞则不受其影响，可实现外周血中白细胞的分离。

主要操作步骤是：先将肝素抗凝静脉血与6%右旋糖酐溶液按一定比例混合，然后在室温下垂直静置一段时间后，红细胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白细胞沉降慢而位于上层，即可获取上层细胞。

（三）NK细胞的分离

正常人外周血中，NK细胞占淋巴细胞总数的5%～15%。其分离的方法主要有免疫磁珠分离法和流式细胞术分离法。NK细胞的表面标志为CD56^＋CD16^＋CD3^－CD19^－CD14^－，借此可以与PBMC中的T细胞（CD3^＋）、B细胞（CD19^＋）和单核细胞（CD14^＋）分离。

四、分离细胞的保存和活力测定

分离细胞需要适当的保护，否则细胞活力将快速下降，甚至死亡。将分离的细胞用适量的含有10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc－199或RPMI1640等培养液稀释重悬。若短期保存，置于4℃温度即可。若需长期保存，应置于液氮罐中。细胞冷冻时，降温应慢速（即“慢冻”），解冻时，升温则宜快速（即“快融”）。

细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示。测定细胞活力的常用方法是台酚蓝染色法。台酚蓝是一种阴离子型染料，这种染料不能透过正常的细胞膜，故活细胞不着色，死亡细胞则着蓝色。用血细胞计数器计数200个细胞，以不着色细胞的百分率表示细胞的活力。