人工培养细菌的用途

第十三章　细菌的生长繁殖与代谢

学习目标

1．掌握细菌生长繁殖的条件及生长曲线。

2．熟悉细菌生化反应及细菌合成代谢产物。

细菌虽小，也有独立的生命活动，必须进行营养、新陈代谢、生长繁殖等生理活动。细菌不断从外界环境中摄取营养物质，合成菌体自身成分，并获得代谢能量;同时不断排出代谢废物，完成新陈代谢，得以生长繁殖。细菌的代谢产物，对环境和人类产生有益或有害的作用。因此，了解细菌生长繁殖和代谢的规律，不仅在医学实践中有重要的意义，也可进一步调控细菌，发挥其有益作用，消除其有害作用，为人类服务。

第一节　细菌的营养与生长繁殖

一、细菌的营养物质

细菌生长繁殖所需的营养物质如下。

1．水分　水是各种生物细胞所必需的，是良好的溶剂，细菌营养的吸收和渗透、分泌及排泄都以水为介质，细菌代谢过程中的一切反应都必须有水才能进行。

2．碳源　主要用来构成菌体成分和提供生理活动所需要的能量。病原菌主要从糖类、有机酸等有机碳化合物中获取碳源。

3．氮源　主要用来构成菌体成分和代谢产物中的含氮物质，一般不用做能量来源。多数病原菌的氮源主要是蛋白质及其降解产物(如胨、肽、氨基酸等)。

4．无机盐　细菌需要钾钠、钙、镁、铁、硫、磷等无机盐，其主要功能是构成菌体成分，调节细胞渗透压和酸碱平衡，以及激活或构成细菌的酶类。

5．生长因子　是某些细菌生长繁殖所必需而细菌本身又不能合成的有机物质，主要包括B族维生素、芳香族氨基酸、嘌呤和嘧啶，它们是构成酶的辅基、辅酶以及核酸的组成成分。此外，少数细菌需要特殊的生长因子，如X因子和V因子，它们均存在于血液中。X因子是细胞色素和过氧化氢酶的辅基，V因子是脱氢酶的辅酶，这些都是细菌呼吸必需的物质。

二、细菌的生长繁殖

(一)细菌生长繁殖的条件

细菌从外界环境中摄取营养物质，经过新陈代谢，导致细菌的生长繁殖。细菌生长繁殖所需的条件如下。

1．充足的营养　正如前述，细菌的生长繁殖需要有足够的碳源、氮源、无机盐、水和必要的生长因子。充足的营养物质可以为细菌的新陈代谢及生长繁殖提供必要的原料和能量。

2．合适的酸碱度　大多数细菌最适酸碱度为中性或弱碱性，即pH值为7．2～7．6，在宿主体内极易生存。个别细菌在偏酸或偏碱的环境中生长良好，如结核杆菌最适pH值为6．5～6．8，霍乱弧菌最适pH值为8．4～9．2。在适当的pH值时细菌的酶活性最强。许多细菌在生长过程中分解糖类产酸，使培养基pH值下降，影响细菌的继续生长，故在培养基中要加入适当的缓冲剂。

3．适宜的温度　各类细菌对温度的要求各不相同，可分为嗜冷菌、嗜温菌、嗜热菌三大类。病原菌已适应人体环境，均为嗜温菌，最适生长温度为人体体温，即37℃。

4．必要的气体环境　与细菌生长繁殖有关的气体主要是氧气和二氧化碳。根据各种细菌对氧气的需要不同，可分为4类。

(1)专性需氧菌(obligate aerobes)此类细菌具有完善的呼吸酶系统，需要分子氧作为最终受氢体以获得能量，因此必须在大气氧环境中才能生长，如结核杆菌、霍乱弧菌等。

(2)专性厌氧菌(obligate anaerobes)缺乏完善的呼吸酶系统，利用氧以外的物质作为受氢体，只能在无氧环境中进行发酵。专性厌氧菌不仅不能利用分子氧，而且游离氧对其有毒性，与大气氧接触，会导致细菌死亡，如类杆菌属和梭杆菌属的多数细菌。

(3)兼性厌氧菌(facultative anaerobes)　是一类在有氧和无氧条件下均能生长繁殖的细菌，兼有有氧呼吸和无氧发酵两套酶系统，大多数病原菌属此类，如葡萄球菌、大肠杆菌等。

(4)微需氧菌(microaerophilic bacterium)在低氧压(5%～6%)生长最好，氧浓度＞10%对其有抑制作用，如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌。

专性厌氧菌在有氧环境中不能生长，可能由于下述原因。

一是缺乏氧化还原电势(Eh)高的呼吸酶:各种物质均具固有Eh，在氧化还原过程中只有高Eh物质才可氧化低Eh物质。人组织Eh约为150 mV，有氧环境中的普通培养基Eh可达300 mV，细菌必须具有像细胞色素和细胞色素氧化酶这样具更高Eh的呼吸酶，才能氧化环境中的营养物质。专性厌氧菌缺乏此类酶，不能利用营养物质产生能量，故不能生长。

二是缺乏分解有毒氧基团的酶:细菌在有氧环境中代谢，常产生具强烈杀菌作用的超氧离子()和过氧化氢(H2O2)。需氧菌有超氧化物歧化酶SOD和触酶，前者将 还原成H2 O2，后者将H2 O2分解为水和分子氧。

有的细菌不产生触酶，而是产生过氧化物酶，将H2O2还原成无毒的水分子。

专性厌氧菌缺乏这三种酶，故在有氧时受到有毒氧基团的影响，不能生长繁殖。

一般细菌的代谢过程都需要二氧化碳，但多数细菌在代谢过程中所产生的二氧化碳已能满足其生长的需要。然而有少数细菌，如脑膜炎奈瑟菌，在初次分离时要供给5%～10%的二氧化碳才能生长，一旦分离成功，不必再补充二氧化碳也可继续培养。

(二)细菌生长繁殖的方式和速度

1．细菌的繁殖方式　细菌以无性二分裂方式进行繁殖。在适当生长条件下，细菌摄取营养物质，有规律的增长，开始仅表现为细胞体积的增大，伴有染色体的复制和各种细胞成分的合成，最后分裂成2个细菌。通常将细胞体积的增大称为生长，将细菌个体数目的增加称为繁殖。

球菌可从通过球心的不同平面分裂，分裂后形成不同的排列方式。杆菌则沿横轴分裂，个别杆菌以分枝方式繁殖，如结核分枝杆菌。革兰阳性菌的染色体与中介体相连，当染色体复制时，中介体也一分为二，各向两端移动，分别拉着复制好的一根染色体移到细胞的一侧。接着细胞中部的细胞膜内陷，形成横隔，细胞壁也向内生长，成为2个子代细胞的胞壁，最后2个细胞完全分离，形成2个子代细菌。革兰阴性菌的染色体直接结合在细胞膜上，复制产生的新染色体则附着在该染色体结合点的附近，在两点之间形成新的细胞膜，细胞壁内陷，整个细胞分裂成2个子代细胞。

2．细菌的繁殖速度与生长曲线　在适宜条件下，多数细菌繁殖速度极快，分裂一次仅需20 min。若保持此速度繁殖，10 h后，一个细菌可以繁殖成10亿个。但由于营养物质的消耗、毒性代谢产物的积聚等，事实上不可能始终保持这样的繁殖速度。培养到一定时间，细菌死亡的速度也逐渐加快。个别细菌繁殖速度缓慢，如结核杆菌繁殖一代约需18 h。

将一定数量的细菌，接种在合适的液体培养基中，间隔一定时间取样检查活菌数目，可看到其生长过程具有一定的规律性。以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线(图13－1)。

根据生长曲线，可将细菌的生长繁殖分成4个时期。

(1)迟缓期　为最初培养1～3 h，细菌体积增大，代谢活跃，但不分裂，菌数不增加，是细菌适应新环境，为繁殖做准备的阶段。

(2)对数生长期或指数期　培养8～18 h，细菌生长迅速，以恒定的速度进行分裂繁殖，菌数以几何级数增长，细菌数目呈对数直线上升。此期细菌的形态、染色性、生理活性等都较典型，对抗菌药物也最敏感，因此是研究细菌性状的最好时期。

图13－1　细菌的生长曲线

(3)稳定期　由于培养环境中营养物质大量消耗，代谢产物积累及pH值的改变，细菌生长繁殖速度下降，繁殖与死亡数趋于平衡。在此期中，细菌可出现种种形态和生理的改变，革兰阳性菌的染色反应有可能变为阴性。细菌的一些合成代谢产物，如外毒素、抗生素等，以及芽胞多在此期产生。

(4)衰退期　由于营养物质的耗竭及毒性产物的进一步蓄积，导致活菌数不断减少而死菌数越来越多。此期细菌形态显著改变，出现畸形或自溶，生理代谢活动也趋于停滞。

细菌的生长曲线仅在体外人工培养条件下才会出现。细菌在人或动物体内生长繁殖受机体内部环境的多种因素的影响，并不存在这种典型的生长曲线。

第二节　细菌的代谢产物及意义

细菌的新陈代谢包括分解代谢和合成代谢，都是在细菌酶的催化下进行的。其显著特点是代谢旺盛和代谢类型多样化。分解代谢是将营养物质或胞内物降解为简单的化合物，同时释放能量;合成代谢是将简单的化合物合成为复杂的菌体成分或其他物质，同时消耗能量。细菌的分解代谢产物及合成代谢产物在医学上均有重要价值。

一、细菌的分解代谢产物及生化反应

各种细菌所具有的酶不完全相同，对糖和蛋白质的分解能力和代谢产物亦不一致，通过生化试验的方法检测这些代谢产物，从而鉴别细菌的反应，称为细菌的生化反应。生化反应的种类和方法很多，常用的有以下几种。

1．糖发酵试验　各种细菌分解糖的种类、能力和产物均不一致，是细菌鉴定中的一个重要内容。例如:大肠杆菌能发酵乳糖和葡萄糖，而伤寒沙门菌不能分解乳糖，只能分解葡萄糖;大肠杆菌有甲酸解氢酶，能将发酵糖产生的甲酸进一步分解为二氧化碳和氢，故产酸又产气，而伤寒沙门菌缺乏此酶，发酵葡萄糖只产酸不产气。

2．靛基质试验　某些细菌如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸生成靛基质(吲哚)，靛基质本身无色，若向培养物中加入对二甲基氨基苯甲醛试剂后，则生成红色的玫瑰靛基质，为靛基质试验阳性。

3．硫化氢试验　有些细菌如变形杆菌、乙型副伤寒杆菌等，能分解培养基中的胱氨酸等含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的醋酸铅或硫酸亚铁形成黑色的硫化铅或硫化亚铁，为硫化氢试验阳性。

4．VP试验　产气杆菌将分解葡萄糖产生的丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇，若加入氢氧化钾，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧所氧化，生成二乙酰;二乙酰与培养基中的胍基发生反应，生成红色化合物，称VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲基甲醇，VP试验为阴性。

5．甲基红试验　在VP试验中，产气杆菌将分解葡萄糖产生的2分子酸性的丙酮酸缩合成1分子中性的乙酰甲基甲醇，使培养液中酸类较少，pH值偏高;而大肠杆菌不能将丙酮酸缩合，则酸性物质较多，pH值偏低。用甲基红指示剂测试pH值时，大肠杆菌培养液呈红色，为甲基红试验阳性。产气杆菌培养液呈橘黄色，为阴性。

6．枸橼酸盐利用试验　产气杆菌能利用枸橼酸盐为碳源，在仅含枸橼酸盐作为唯一碳源的培养基中能生长，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解铵盐生成氨，使培养基由弱酸性变成碱性，导致培养基中指示剂变色，为阳性反应。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，在此培养基上不能生长，培养基不变色，为阴性。

细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段，其中靛基质(Ⅰ)、甲基红(M)、VP(V)、枸橼酸盐利用(C)四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMVIC试验。

二、细菌的合成代谢产物及其医学上的意义

细菌在合成代谢过程中，除合成自身菌体成分外，尚可合成一些其他代谢产物，这些产物有的与细菌致病作用有关，有的可用于鉴别细菌或防治疾病。

1．热原质　许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌能合成一种脂多糖，注入人或动物体内可引起发热反应，称为热原质(pyrogen)。热原质耐高温，121℃20 min高压蒸气灭菌也不被破坏。注射用的药物、生物制品、抗生素等均不应含有热原质。注射用制剂必须用无热原质的蒸馏水配制，玻璃器皿和用具要经160～170℃干烤4 h，才能破坏热原质。

2．毒素和侵袭性酶　细菌产生的毒素有内毒素和外毒素两种。内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌细胞壁中的脂多糖，当细菌死亡裂解后释出;外毒素(exotoxin)是革兰阳性菌或少数革兰阴性菌在生命活动中合成并不断分泌到菌体外的毒性蛋白质。此外，某些细菌还能产生一些与侵袭力有关的酶，称为侵袭性酶，如金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶、链球菌产生的透明质酸酶等。毒素和侵袭性酶在细菌致病作用中甚为重要。

3．抗生素　抗生素(antibiotic)是某些细菌(主要是放线菌)和真菌在代谢过程中产生的一种物质，能抑制和杀死某些微生物和癌细胞，是临床应用最广泛的抗菌药物。

4．细菌素　细菌素(bacteriocin)是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质。但与抗生素不同，细菌素作用范围狭窄，仅对与产生该种细菌素的细菌有近缘关系的细菌才有作用。如大肠杆菌产生的大肠菌素、绿脓杆菌产生的绿脓菌素等均属此类。

5．维生素　细菌能合成某些维生素，除供自身需要外，也能分泌至菌体外。如人体肠道内的大肠杆菌合成的维生素B及维生素K等，可分泌至肠腔，供人体吸收利用。

6．色素　某些细菌在一定条件下能产生各种颜色的色素。有些色素是水溶性的，能弥散到培养基中，使周围培养基呈现颜色，亦可使脓汁带有颜色，如绿脓杆菌产生墨绿色色素;有些色素是脂溶性的，不溶于水，人工培养时仅菌落呈色，而培养基颜色不变，如金黄色葡萄球菌色素。不同细菌可有不同色素，在细菌鉴别上有一定意义。

第三节　细菌的人工培养

根据细菌的生长条件和繁殖规律，可用人工方法提供细菌所需要的营养成分和环境条件，使之生长繁殖，称为细菌的人工培养。细菌的人工培养，在传染病的诊断、流行病学的调查以及生物制品的研制等方面均有实际意义。

一、培养基

培养基(culturemedium)是由适合于细菌需要的各种营养物质配制而成的营养基质。培养基必须含有细菌生长繁殖所需的营养物质，并调节pH值为7．2～7．6，培养基本身必须无菌。按培养基性质和用途不同，可分为以下几类。

(一)基础培养基

基础培养基:含有细菌生长繁殖所需的基本营养成分，适合大多数细菌生长。最常用的是肉汤培养基。

(二)营养培养基

营养培养基:在基础培养基中加入葡萄糖、血清、酵母浸膏、生长因子等，可供营养要求较高的细菌生长，最常用的是血琼脂培养基。

(三)鉴别培养基

鉴别培养基:在基础培养基中加入糖或蛋白质等细菌作用底物，并加入相应指示剂，根据各种细菌对底物的分解作用及代谢产物的不同，用于细菌的鉴别，如单糖发酵管、醋酸铅培养基、伊红美蓝平板等。

(四)选择培养基

选择培养基:在基础培养基中加入某种化学物质，使之抑制某一类细菌生长，而有利于另一类细菌生长，从而将后者选择出来。如分离肠道病原菌的SS培养基，其中含有胆酸盐能抑制革兰阳性菌的生长，因而能选择性地使肠道致病菌生长。

(五)厌氧培养基

厌氧菌必须在无氧或氧分压低的环境中才能生长，因此，用来培养厌氧菌的培养基本身应是一个无氧环境。常用的厌氧培养基有庖肉培养基和硫乙醇酸钠培养基。庖肉培养基是在肉汤培养基中加入煮过的肉渣，因肉渣中含有不饱和脂肪酸和谷胱甘肽等还原性物质，种入细菌后在培养基表面覆盖凡士林或用石蜡封闭，以免外界空气进入，使培养基本身成为无氧环境，适于厌氧菌生长。硫乙醇酸钠亦是还原剂，可去除培养基中的氧气并使氧化型物质还原。

另外，培养基尚可按物理性状分为液体、固体、半固体三大类。液体培养基可大量繁殖细菌，但通常应种入纯种细菌，若有多种细菌，则混杂生长，不易分开。液体培养基中加入2%～3%琼脂，即凝固成固体培养基，可用于细菌的分离培养。当琼脂含量为0．2%～0．5%时，为半固体培养基，可用于观察细菌动力和保存菌种。

二、细菌在培养基上的生长现象

将细菌接种于培养基，置37℃温箱孵育，大多数细菌培养18～24 h后，即可观察到生长现象，个别生长缓慢的细菌，则需培养数日或数周。

(一)细菌在液体培养基中的生长现象

大多数细菌呈均匀混浊生长，专性需氧菌多生长在液体表面，形成菌膜，如枯草杆菌;少数细菌在液体底部形成絮状沉淀物，呈沉淀生长，如链球菌等。

(二)细菌在固体培养基上的生长现象

将细菌划线接种在固体培养基表面，由于划线的分散作用，使许多混杂的细菌在培养基表面分散，培养一定时间后，单个细菌繁殖形成肉眼可见的细菌集团，称为菌落(colony)。一个菌落是由一个细菌繁殖而来的，为纯种细菌。各种细菌的菌落在大小、形态、颜色、气味、透明度、表面光滑度、湿润度、边缘是否整齐等方面均有不同表现，有助于识别和鉴定细菌。当细菌在固体培养基表面密集生长时，多个菌落融合在一起称为菌苔。

(三)细菌在半固体培养基中的生长现象

半固体培养基琼脂含量少，细菌可在其中移动。用接种针将细菌穿刺接种于半固体培养基，有鞭毛的细菌可沿穿刺线生长并向四周游动扩散，使培养基呈混浊状，穿刺线模糊不清。无鞭毛的细菌只沿穿刺线生长，而线周围培养基仍透明澄清，故半固体培养基可用来检查细菌的动力。

三、人工培养细菌的用途

(一)细菌的鉴定和研究

对细菌进行鉴定，研究其形态、代谢、生化反应、免疫原性、致病性等，均需首先培养细菌，使细菌繁殖到一定数量，以供研究。

(二)传染病的诊断与治疗

要确定某一传染病是由何种细菌感染所引起，必须从患者体内分离出病原菌，通过培养并鉴定其种属，才能做出确切的病原学诊断。还可用病原菌做药物敏感试验，测定该菌对何种药物敏感，以指导临床选择有效的药物进行治疗。

(三)生物制品的制备

人工培养的纯种细菌，可进一步制成菌苗、疫苗、类毒素等，供人体接种以预防各种传染病;将培养的细菌或类毒素注入动物，制成免疫血清与抗毒素，可用于传染病的诊断、预防与治疗。

(四)其他方面

许多抗生素、维生素、氨基酸、有机溶剂、酒、酱油、味精等都是细菌培养和发酵的产物，经提纯精制而得。细菌培养物还可以生产酶制剂，处理废水和垃圾，制造菌肥和农药等，因而在工农业生产中广泛应用。在基因工程方面，常用细菌作为基因受体，利用细菌繁殖快、易培养等特点，将目的基因植入工程菌，让其产生人类所需要的蛋白质。例如，用基因工程生产胰岛素、干扰素、白细胞介素、乙型肝炎疫苗等均获成功。

(李亚辉)