细菌的消毒与灭菌的方法

第十四章　细菌的分布与消毒灭菌

学习目标

1．掌握正常菌群、条件致病菌、菌群失调、消毒、灭菌、防腐、灭菌的概念。

2．熟悉高压蒸气灭菌法、紫外线杀菌的原理、杀菌特点及应用范围。

第一节　细菌的分布

细菌种类多，繁殖快，适应环境能力强，因此自然界中分布很广。土壤、空气、水、物体表面、动植物体和人体体表以及与外界相通的腔道中，都有许多种类不同的微生物存在。了解细菌分布的场所和种类，对于建立无菌观念，严格无菌操作，防止医院内感染等均有重要意义。

一、细菌在自然界的分布

(一)土壤中的细菌

土壤中含有细菌生长所需的营养物质、水分、适宜的酸碱度和气体环境，因此，土壤中细菌数量之多是十分惊人的。1 g肥沃的土壤，细菌数以亿万计。大部分细菌在离地面10～20 cm土壤中，越深层的土壤细菌含量越少;土壤表面，因有阳光直接照射，且较干燥，菌类数量亦较少。

土壤中细菌种类也很多，其中绝大多数是非致病菌，包括天然生活在土壤中的自养菌和随动物尸体进入土壤的腐物寄生菌，它们在自然界的物质循环中起重要作用，是动植物和人类生存的必要条件之一。土壤中的病原菌主要来自人和动物尸体或其排泄物。多数病原菌在土壤中存活期很短，如伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌等。结核杆菌抵抗力较强，在干燥土壤中能存活数月。只有能形成芽胞的细菌，才能长期存在，如炭疽杆菌、破伤风杆菌、产气荚膜杆菌的芽胞，在土壤中可存活数年乃至数十年。土壤中的病原菌主要与某些消化道传染病和厌氧芽胞杆菌的创伤感染有关。

(二)水中的细菌

水也是细菌生存的天然环境。水中细菌主要来自土壤，部分随空气中尘埃而进入，人、畜等动物的排泄物也能污染水源。水中细菌的数量及种类受很多因素的影响，如水的性质、有机物的含量、深度、流速、温度、阳光照射等。一般是流动水比静止水含菌量少，地下水比地面水含菌量少。水中的病原菌主要来源是人和动物的粪便，常见的有伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌等，此外，还有钩端螺旋体、甲型肝炎病毒等病原微生物。其中霍乱弧菌、钩端螺旋体、甲型肝炎病毒在水中生存力较强。因此，水源的污染是引起消化道传染病和钩端螺旋体病传播的主要原因。保护水源、注意饮水卫生，是预防消化道传染病的重要环节。我国1985年公布的生活饮用水标准(GB 5749－85)中规定，细菌总数为≤100/ 1 mL，大肠菌群数为≤3/1 000 mL;2007年7月公布的修订标准(GB 5749－2006)为饮用水不得含有微生物。

(三)空气中的细菌

空气本身缺乏维持细菌生活所必需的营养物，而且干燥、日光对细菌的生命活动也极为不利，故一般空气中细菌很少。但由于人群和各种动物不断排出细菌，土壤中的细菌随尘土散布于空气中，因此空气中仍含有不同种类的细菌。空气中的致病菌主要来自尘埃以及人类高声说话、喷嚏、咳嗽产生的飞沫。一般在人口密集、通风不良的公共场所及医院，空气中细菌的数量和种类明显增多，尤其是医院病房、门诊，经常受患者污染，病原菌数量较多。空气中常见的病原微生物有结核杆菌、白喉杆菌、脑膜炎球菌、链球菌，以及流感病毒、麻疹病毒、真菌孢子等，常引起呼吸道传染病。另外，空气中的非病原菌，常可造成生物制品、培养基、药物制剂等的污染。

研究微生物在人类的生存环境——土壤、水、空气、食品等的消长、分布和种类，对各类环境的影响以及可能对人体的利害，对环境质量进行综合评价，是改善人类居住环境和预防疾病的重要课题。

二、细菌在正常人体的分布

人体体表及与外界相通的腔道，如呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位，存在着不同种类一定数量的细菌(表14－1)。

(一)皮肤

皮肤表面的细菌种类和数量可因个人卫生及环境情况而有差异。通常皮肤上最常见的细菌是革兰阳性球菌，其中以表皮葡萄球菌为多见。当皮肤受损时，这些细菌可趁机侵入，引起化脓性感染。在腋窝和腹股沟等比较潮湿的皮肤上，除球菌外，革兰阴性杆菌和类白喉杆菌较多见。在外阴部与肛门部位，可找到非致病性的抗酸性耻垢杆菌。

(二)口腔与消化道

口腔中经常有一些脱落的黏膜上皮细胞和食物残渣，且温度和湿度也适合细菌的生长，因此，口腔中存在着大量细菌，最常见的细菌有革兰阳性球菌、奈瑟球菌、梭形杆菌、乳酸杆菌、螺旋体和真菌等。这些细菌与口腔黏膜的感染和龋齿的发生有关。

胃肠道不同部位所含细菌的种类和数量均有差异。胃中因有胃酸，细菌含量很少，除少数耐酸菌外，进入胃的细菌很快被杀死。若胃功能障碍、胃酸分泌降低，往往出现八叠球菌和腐生杆菌。成年人空肠和回肠上部细菌也是很少的，甚至无菌，肠道下段细菌逐渐增多。大肠中则含有大量细菌，菌量占粪便干重的1/3。其中无芽胞厌氧菌(如乳酸杆菌、双歧杆菌、粪链球菌等)及大肠杆菌占菌数的90%以上。随着年龄和食物的变化，肠道中细菌的种类也会发生变化。如母乳喂养的婴儿，肠道内以乳酸杆菌和双歧杆菌为主，成年人肠道中乳酸杆菌双歧杆菌很少，大肠杆菌增多。胃切除后及肝硬化、胃肠炎和一些慢性疾病，会导致肠道上部出现细菌。肠道中细菌的变更，也会导致多种疾病的发生。

表14－1　正常人体各部位常见的微生物

(三)呼吸道

上呼吸道黏膜上经常存在着葡萄球菌、类白喉杆菌、甲型链球菌和革兰阴性球菌。在咽喉部也经常潜伏着致病菌，如肺炎链球菌、溶血性链球菌、流感杆菌及金黄色葡萄球菌等。这些细菌在机体抵抗力降低时，可引起局部或全身感染。由于支气管黏膜表面纤毛的运动不断清除细菌，使呼吸道下段的气管和支气管内细菌逐渐减少，因此，正常人的支气管末梢和肺泡是无菌的。

(四)泌尿生殖道

正常机体，仅在泌尿生殖器外部有细菌存在。如男性的生殖器外部有耻垢杆菌，尿道口有葡萄球菌和革兰阴性球菌及杆菌;女性尿道外部与外阴部菌群相仿，有葡萄球菌、类白喉杆菌、肠球菌、大肠杆菌等，一般没有病原菌存在。阴道内有大量乳酸杆菌，可酵解上皮细胞的糖原产生大量乳酸，使阴道保持pH值4．0～5．0的环境，能抑制有害微生物的生长，维持阴道的自净作用。健康妇女宫颈外口有厌氧菌存在，子宫腔内是无菌的。

(五)其他

眼结膜由于分泌液的冲洗和溶菌酶的杀菌作用，通常是无菌的，有时有表皮葡萄球菌和结膜干燥杆菌存在。正常人血液和内脏器官通常是无菌的，但有时机体黏膜表面的细菌会进入血液和器官组织中，往往由于机体正常的防御功能而很快被消灭。

三、人体正常菌群及其意义

(一)正常菌群的概念

正常人体体表和与外界相通的腔道黏膜上，寄居着一定数量、不同种类的微生物(以细菌为主)，这些微生物通常对人体无害有些对人还有利，称为人体的正常微生物群或正常菌群(normal flora)。正常菌群不仅与人体间经常维持相对平衡，而且在人体某一部位寄居的各种细菌之间也存在相互依存、相互制约的关系，其组成和数量也处于不断变化的动态平衡之中。

(二)正常菌群对人体的有利作用

正常菌群生理学意义的主要表现如下。

1．促进入体的消化和吸收，肠道正常菌群可将不溶性的蛋白质、糖类转化为可溶状态，有利于人体的吸收。

2．营养作用，正常菌群中的大肠杆菌、乳链球菌等能合成维生素B2、维生素B12、泛酸、叶酸、维生素K等，供人体吸收利用;双歧杆菌产酸造成的酸性环境，可促进入体对维生素D、钙、铁的吸收。

3．生物拮抗作用，正常菌群在人体体表及与外界相通的腔道黏膜上组成生物屏障，可阻挡病原菌的入侵，如口腔中唾液链球菌，可产生过氧化氢，抑制脑膜炎球菌的生长，大肠杆菌产生大肠菌素，抑制肠道致病菌的生长。

4．免疫作用，正常菌群可以刺激机体免疫系统的发育和成熟，并具有免疫原性、促分裂作用和佐剂作用。

5．抗衰老作用，肠道正常菌群中的双歧杆菌有抗衰老作用。健康乳儿肠道中，双歧杆菌约占肠道菌群的98%。成年后，这类菌数量大减，代之以其他菌群。进入老年后产生H2 S和吲哚的芽胞杆菌菌类增多，这些有害物质吸收后，可加速机体的衰老过程。

6．正常菌群可能有一定的抑瘤作用，其机制是转化某些致癌物质成非致癌性，激活巨噬细胞等免疫功能。

(三)正常菌群在某些条件下的致病作用

由于细菌寄居部位改变或当机体免疫力下降时，正常菌群细菌也可引起疾病，因此称这些细菌为条件致病菌或机会致病菌。条件致病菌所致疾病以内源性感染或继发性感染为主，引起正常菌群成为条件致病菌的因素如下。

1．细菌寄居部位改变　在某一部位寄生的正常菌群细菌，因损伤、手术、插管、针刺等因素，进入其他部位生长繁殖而致病。如肠手术中，大肠埃希菌进入腹腔或血流，引起腹腔炎或败血症;导尿插管时，尿道口细菌进入尿道深处，引发膀胱炎或肾盂肾炎。

2．机体免疫力下降　机体因慢性疾病、放射治疗、大量使用激素或患肿瘤导致免疫力下降，原来与机体免疫系统保持平衡状态的正常菌群即可由黏膜部位乘虚而入，引起寄生原位感染，重者可致败血症死亡。

3．菌群失调　当某些因素破坏了人体与正常菌群之间的平衡或正常菌群中各种细菌的数量、比例发生变化时，造成一种或几种细菌大量增殖，称为菌群失调(dysbacteriosis)。若菌群失调没有得到有效控制，出现临床细菌感染症状，称菌群失调症。出现菌群失调症的原因主要是不合理使用或滥用抗生素造成的。大量使用抗生素，多数敏感的正常菌群细菌被杀掉，少数抗药菌或外来菌得到大量繁殖而致病。如因长期使用抗生素造成的金黄色葡萄球菌假膜性肠炎、妇科抗炎性治疗过程中出现的真菌性阴道炎等。

第二节　消毒与灭菌

微生物普遍存在于自然界、人体体表及与外界相通的腔道中，可通过各种途径进入人体导致感染，或污染环境及医疗用品，若是病原微生物还会造成疾病的流行。因此，采取一定的措施杀灭对人体有害的微生物，在医疗、卫生防疫、科研、制药等方面都是非常重要的。对于切断传播途径、保护人民健康、控制和消灭传染病也有着十分重要的意义。

消毒与灭菌的基本概念如下。

1．消毒(disinfection)杀死物体上病原微生物的方法，一般只能杀死繁殖体，不能杀死芽胞。消毒时常使用化学消毒剂。

2．灭菌(sterilization)杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物的繁殖体和芽胞。

3．防腐(antisepsis)防止或抑制微生物生长繁殖的方法。防腐通常应用防腐剂，一般不能杀死细菌，在医学中常用于保存生物制品。

4．无菌(asepsis)不含活菌的意思。防止微生物进入机体或物体的操作方法称为无菌操作。例如进行外科手术时需防止细菌进入创口，微生物实验过程中要防止污染和感染。

常用的消毒灭菌法可归纳为两大类:物理方法和化学方法。

一、物理方法

用于消毒、灭菌的物理方法主要有:热力灭菌法、电磁波射线灭菌法、超声波杀菌和滤过除菌法。

(一)热力灭菌法

高温能使微生物蛋白质凝固变性，故高温有显著的杀菌作用。热力灭菌的杀菌效果除与温度高低、热力方式和作用时间长短有关外，尚与细菌种类、有无芽胞、菌龄等因素有关。多数细菌繁殖体在56～60℃、30～60min死亡，100℃时迅速死亡。有芽胞的细菌对高温有很强抵抗力，需用较高温度和较长时间才能被消灭。

1．常用的热力灭菌法主要有下列几种。

(1)高压蒸气灭菌法(autoclaving)　是利用密闭的高压蒸气锅，使蒸气不外溢，则随锅内蒸气压力的不断增高，温度也随之增高，杀菌效力也越强。通常使用1．013×105 Pa (15磅)压力，此时温度可达121．3℃，维持15～30 min，可杀死包括芽胞在内的所有微生物。因此法杀菌效力强、效果可靠，是目前临床最常用的灭菌方法。凡是耐高温、不怕潮湿的物品均适用于此灭菌法，如外科手术器械、敷料、生理盐水、橡皮手套、普通培养基等。在进行灭菌时，应注意灭菌物品放置不宜过于紧密挤压，并应将锅内冷空气排净，方能达到一定的温度。为了保证灭菌效果，还应定期检查灭菌器的效能，可将一定量的硫黄粉(熔点120℃)随物品放入锅内，灭菌后硫黄粉熔化，可认为灭菌效果可靠。

(2)干烤法　是利用密闭的电热干烤箱加热空气进行灭菌。一般加热160～170℃，维持2～4 h，可杀死包括芽胞在内的所有微生物，也能破坏热原质。适用于玻璃器皿、油类制剂、粉剂药品等怕潮湿物品的灭菌。

(3)煮沸法　煮沸100℃5 min可杀死一般细菌繁殖体，用于饮水、餐具和一般外科器械的消毒。煮沸1～2 h，可杀死芽胞。若水中加入1%～2%碳酸氢钠，能提高沸点达105℃，既可促进杀死芽胞，又可防止金属器械生锈。

(4)流通蒸气法　是用蒸笼或用阿诺蒸锅，其温度一般不超过100℃，经15～30 min可杀死细菌繁殖体。若将经流通蒸气加热的物品放置37℃孵箱过夜(不超过16 h)，使其中芽胞变成繁殖体，次日再经流通蒸气加热，如此重复3次，可达到灭菌的目的，称为间歇灭菌法(tyndallization)。流通蒸气法和间歇灭菌法常用于不耐高温的营养物品，如含糖或含血清的培养基灭菌。

(5)巴氏消毒法(pasteurization)　是由巴斯德首创，适用于牛奶、酒类等不耐高温物品的消毒。此法是利用较低的温度杀灭液体中无芽胞的病原菌，同时也不影响消毒物品的营养成分及香味。消毒方法为61．1～62．8℃30 min或71．7℃15～30 s。

(6)焚烧或烧灼　焚烧仅用于废弃的污染物品或死于传染病的患者和动物尸体。对于金属器械、接种环、试管口可通过火焰烧灼灭菌。

2．热力灭菌的机制及湿热与干热灭菌作用比较　热力灭菌的机制主要是细菌蛋白质及酶类，因加热而发生变性或凝固，活性消失，代谢发生障碍，导致细菌死亡。热力灭菌法可归纳为湿热灭菌与干热灭菌两类。湿热灭菌指通过水或热蒸气使温度升高，以达杀菌目的，干热灭菌则是通过热空气起杀菌作用的。在上述热力灭菌方法中，除干烤、焚烧、烧灼法属干热灭菌外，其余均属湿热灭菌。在灭菌时间和温度相同情况下，湿热灭菌比干热灭菌效果好，其原因有:①蛋白质在含水多的环境中遇热容易凝固;②湿热传导快、穿透力强，可使被灭菌的物体内部温度迅速上升，而热空气传导慢，穿透力差;③湿热的蒸气含有潜热。当被灭菌物体的温度比蒸气低时，蒸气接触到物体表面便凝结成水，同时放出潜热，使灭菌物体的温度迅速升高。

(二)电磁波射线灭菌

电磁波射线灭菌，主要包括日光、紫外线和电离辐射灭菌。

1．日光与紫外线　日光是有效的天然杀菌因素，许多细菌在日光直接照射下易死亡。患者的衣物、被单、书报等在日光下曝晒数小时，可杀死其中大部分细菌。日光杀菌作用的主要成分是紫外线。紫外线的波长在200～300 nm时，具有杀菌作用，其中以265～266 nm波长杀菌力最强，这与细菌DNA吸收光谱范围相一致。细菌DNA吸收紫外线后可造成多种损伤，主要是使同一股DNA上相邻的嘧啶通过共价键结合成二聚体，影响DNA碱基的正常配对，从而导致细菌突变或死亡。同时，紫外线还能使空气中的氧转变为臭氧而具有杀菌作用。紫外线穿透力弱，玻璃、纸张、尘埃、水蒸气等均能阻挡紫外线，因此，紫外线仅用于手术室、婴儿室、烧伤病房、传染病房、无菌室等空气的消毒及物体表面的消毒。在使用紫外线消毒灭菌时，应注意光源与被消毒物品的距离及照射时间，同时应注意自身防护，因紫外线对人皮肤、眼睛均有损害，不要在紫外线灯照射下工作。

2．电离辐射　电离辐射具有较高的能量和穿透力，对细菌可产生极强的致死效应。常用于灭菌的射线有γ射线、β射线和阴极射线。其杀菌机制一方面是射线的能量可直接破坏微生物的核酸、蛋白质和酶;另一方面是射线可使邻近分子电离产生自由基，间接破坏核酸、蛋白质和酶。由于电离辐射具有不使物品升温、穿透力强、简便易行、适宜于连续生产线使用等优点，因此，常用于不耐热的医疗用品、药物和食品等的处理。

3．滤过除菌法(filtration)是用机械方法将液体或空气中的细菌除去。常用的滤菌器有玻璃滤器G5、G6型以及蔡氏滤器EK滤板和0．45μm以下孔径的薄膜滤器。滤菌器的除菌能力取决于滤板或滤膜的孔径，小于孔径的液体物质能够通过，而大于孔径的细菌等不能通过，因此获得无菌的液体。滤过除菌，主要用于一些不耐高温灭菌的血清毒素、抗毒素、药液等的除菌，也用于实验室超净工作台中空气的除菌。滤菌器一般不能除去病毒、支原体和L型细菌。

二、化学方法

用于消毒灭菌的化学方法，是指利用某些化学药品杀死或抑制微生物的方法。许多化学药品在高浓度时有杀菌作用，在较低浓度时仅能防止或抑制微生物的生长繁殖。通常将具有杀菌作用的化学药品称为化学消毒剂，用于抑制微生物生长繁殖的化学药品称为防腐剂。由于这类化学药品对细菌及人体都有毒性，所以只能外用，主要用于体表(皮肤、黏膜、伤口等)、器械、排泄物和周围环境的消毒。理想的消毒剂应是杀菌力强，价格低，能长期保存，无腐蚀性，对人、畜无毒性或毒性较小的化学药品。

(一)化学消毒剂的种类及用途

化学消毒剂种类很多，常用的有酚类、醇类、重金属盐类、氧化剂、卤素及其化合物、醛类、表面活性剂、染料、酸碱类等。这些消毒剂性质各异，用途也不相同，详见表14－2。

表14－2　常用消毒防腐剂的种类、浓度和用途

续表14－2

(二)化学消毒剂的作用机制

消毒剂种类繁多，作用机制复杂，主要的杀菌机制有以下几个方面。

1．使菌体蛋白质变性或凝固　重金属盐类、氧化剂、醇类、醛类、染料、酸碱类等化学消毒剂，均能通过与菌体蛋白质结合，改变其构型使菌体蛋白变性，从而起杀菌作用。

2．改变细菌细胞壁或破坏细胞膜使通透性发生改变　表面活性剂能吸附于细菌表面，改变细胞壁的通透性，使菌体内的酶、辅酶和代谢中间产物逸出，呈现杀菌作用;酚类消毒剂能破坏细胞膜，使胞浆内容物漏出而杀菌。

3．干扰微生物的酶系统　有些重金属盐类和氧化剂能改变或破坏微生物胞内酶的功能基，使酶失去活性。

(三)影响消毒剂作用的因素

1．消毒剂的性质、浓度与作用时间　不同的清毒剂有不同的杀菌机制，但均应能溶于水，因为只有溶于水中，消毒剂才能作用于细菌或渗入菌细胞内。一般浓度越大，作用时间越长，杀菌效果越强。但乙醇以70%左右杀菌力最强，其原因可能是更高浓度的乙醇，能使菌体表面蛋白质迅速凝固，而影响乙醇继续渗入菌体内。

2．细菌的种类　不同的细菌对消毒剂的抵抗力不同。细菌芽胞的抵抗力最强，幼龄菌比老龄菌敏感。

3．环境中有机物的存在　消毒剂与环境中有机物结合，能减弱其杀菌力。有机物对细菌有保护作用，并同时与消毒剂发生化学反应，影响杀菌作用，故消毒皮肤及器械时，需先洗净再消毒，对于痰、粪便等应选用受有机物影响较小的消毒剂。

4．温度和酸碱度　杀菌过程是一种化学反应，一般应随温度增高，反应速度加快。故适当提高温度消毒效果更好。细菌在适宜的pH值环境中抵抗力较强，在pH值偏高或偏低的环境中，更易被杀死。例如表面活性剂类消毒剂在碱性溶液中，酚类消毒剂在酸性环境中，均使细菌对消毒剂更为敏感。

(宋献美)