基因诊断和染色体分析的区别

第1节　遗传病的诊断

遗传病的诊断与一般疾病的诊断相比，既有相同的方法，也有遗传学的特殊诊断方法，如家系分析、染色体检查、携带者的检出等。遗传病的诊断是一项复杂的工作，它需要各个学科的密切配合。按照诊断进行的时间，目前临床上的遗传病诊断主要包括临症诊断或现症患者诊断（symptomatic diagnosis）、症状前诊断（presymptomatic diagnosis）和产前诊断（prenatal diagnosis）。

一、临症诊断

临症诊断是医务工作者根据已出现症状的患者的各种临床表现进行分析和确诊，是遗传病临床诊断的主要内容。

（一）病史、症状和体征

1.病史

一些遗传病有家族聚集现象，因此，病史的采集除一般病史外，还应着重询问患者的家族史、婚姻史和生育史等。

2.症状和体征

遗传病既有与其他疾病相同的症状和体征，又有其本身特异性症候群，为诊断提供初步线索。例如：智力发育不全并伴有特殊腐臭尿液，提示为苯丙酮尿症；智力低下并伴有眼距宽、眼裂小、外眼角上斜等体征，要考虑先天愚型；智力发育不全并伴有生长发育迟缓以及五官、四肢、内脏等方面的畸形，提示可能为常染色体病；若有性腺发育不全或生殖能力下降、继发性闭经、行为异常等，可怀疑为性染色体病等。

由于多数遗传病具有遗传异质性，仅凭症状和体征是很难作出病因诊断的，因此，需要进行实验室检验和辅助器械检查才能明确诊断。

（二）系谱分析

准确而有效的系谱记录家族史对遗传病的诊断是非常重要的，最好的方法是绘制系谱。系谱分析有助于区分单基因病和多基因病，以及属于哪一种遗传方式；也有助于区分某些表型相似的遗传病。进行系谱分析应注意系谱的系统性、完整性和可靠性。在分析显性遗传病时，应注意对已知有延迟显性的年轻患者，由于外显不全而呈现隔代遗传的现象，不可误认为是隐性遗传等。此外，在系谱分析中要注意遗传异质性、拟表型等现象。

（三）细胞遗传学检查

1.染色体检查

染色体检查亦称核型分析（karyotype analysis），是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辨率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。染色体检查标本的主要来源有外周血、骨髓、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血、皮肤等各种组织。

染色体检查的适应证主要包括下列几个方面：有明显的智力发育不全、生长发育迟缓或伴有其他先天畸形者；夫妇之一有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等；家族中已出现染色体畸变或先天畸形的个体；多发性流产妇女及其丈夫；原发性闭经和女性不育症；无精子症男子和男性不育症；有两性内外生殖器畸形者；35岁以上的高龄孕妇等。

对疑为两性畸形或性染色体数目异常的疾病诊断或产前诊断，可进行性染色体检查。性染色体检查标本可取口腔上皮细胞、女性阴道的上皮细胞，也可取绒毛和羊水中的胎儿脱落细胞涂片等。例如：X染色体数目计数分析适用于X染色体异常而引起的性染色体畸变综合征的检出，如Turner综合征X染色体为阴性，Klinefelter综合征X染色体为阳性；Y染色体数目计数分析适用于具有1个或1个以上Y染色体的个体，如正常男子只有1个Y小体，而XYY男性有2个Y小体。

2.染色体荧光原位杂交

应用标记的特异性DNA探针与玻片上的染色体或间期核的DNA、RNA杂交，在这些核酸不改变其结构和分布格局的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系，因此称为原位杂交。用生物素、地高辛等标记的DNA探针进行原位杂交后，用荧光染料（罗丹明、DAPI、FITC等）标记的生物素亲和蛋白和抗亲和蛋白的抗体进行免疫检测和放大，使探针杂交的区域发出荧光。这种原位杂交称为荧光原位杂交（fluorescence in－situ hybridization，FISH）。FISH可用于对非整倍体的检测，如单体型和三体型患者；也可对各种结构畸变如染色体微小缺失、插入、倒位等进行检测。该技术具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，已广泛应用于基因定位和基因制图等领域中。

（四）生物化学检查

单基因病往往表现为酶和蛋白质的质和（或）量的改变或缺如，从而累及一些器官的发育和正常的代谢，并在临床上表现出一系列症状。因此，酶和蛋白质的定性、定量分析可反映基因突变，相关的生化检查是遗传病诊断中的重要辅助手段，由于主要采用生化手段，故称之为生物化学检查。例如，用于分析蛋白质变性的方法主要有电泳技术、肽链和氨基酸顺序分析。另外，测定代谢中间产物也有助于诊断代谢病，例如，对怀疑为苯丙酮尿症的患者，可检测其血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸浓度。

目前已知的230多种遗传性代谢病中，多数为酶缺陷病，少数为非酶缺陷病。临床上常用的生物化学检测方法是检测酶的缺陷（表14－1）和代谢中间产物。血和尿液由于容易采集，加之方法的不断改进，一直被检测者采用，目前已制成滤纸片和利用显色反应进行检测。

表14－1　常见的通过酶活性检测而诊断的遗传性代谢病

（五）基因诊断

基因诊断（gene diagnosis）又称为分子诊断，通过对受检者的某一特定基因（DNA）或其转录产物（mRNA）进行分析而对遗传病作出诊断的技术。自从1978年，美籍华裔科学家简悦威（Yuet Wai Kan）首次应用限制性酶切片段长度多态性（RFLP）技术检测出胎儿镰状细胞贫血（βS）以来，基因诊断技术得到了空前高速的发展。它的问世使遗传病诊断从传统的表型诊断步入了基因型诊断的新阶段，是现代分子生物学和分子遗传学在理论和技术上与医学结合的典范，代表了诊断学领域的一次革命。

基因诊断不受取材的细胞类型和发病年龄的限制，也不受基因表达的时空限制，因此，可对那些有表达阶段性和（或）组织特异性的基因作出诊断，可用于产前诊断和症状前的诊断。常用的基因诊断技术有核酸分子杂交、聚合酶链反应（PCR）及相关技术、DNA多态性连锁分析等。

1.核酸分子杂交

核酸分子杂交是应用已知带有某种标记的核酸单链作为探针，在一定条件下，与待测样品的核酸片段进行杂交，从而确定两者的同源程度，鉴定靶序列是否存在、靶序列分子大小以及进行靶序列的相对定量。分子杂交所用的探针可为基因组探针（genomic probe），或是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过反转录得到的cDNA探针（cDNA probe），也可以是体外人工合成的与基因序列互补的寡核苷酸探针。这些探针都需经过某种方法进行标记，以便于杂交结果的分析。

（1）Southern印迹杂交。Southern印迹杂交是最经典和应用最广泛的杂交方法，是将电泳分离得到的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交。利用Southern印迹杂交可进行酶谱分析、基因突变分析、限制性酶切片段长度多态性（RFLP）连锁分析等。

（2）斑点杂交。斑点杂交是直接将被测DNA或RNA样品固定于小孔径硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与经标记的探针进行杂交。根据杂交图谱可知目的基因是否存在，根据杂交条带的放射性强度或光密度可估计待测基因的数量。

2.聚合酶链反应及相关技术

PCR技术能快速、特异地在体外扩增目的基因或DNA片段，现已成为基因诊断的主要方法，特别是多重PCR的应用，使对一些已知致病基因的遗传病得以进行基因诊断，对于像鳞皮病、DMD等基因缺失的单基因病能有效、准确地检出。另外，PCR常能结合其他技术进行基因诊断。

（1）PCR／等位基因特异性寡核苷酸探针杂交。当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele－specific oligonucleotide，ASO），用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常是长20bp左右的核苷酸。用于检测点突变时，一般需要合成两种探针并严格控制杂交条件。一种探针与正常基因序列完全一致，能与正常基因序列稳定杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种探针与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。PCR结合ASO进行基因诊断时，先将可能含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。

对于突变类型已知的一些遗传病，如珠蛋白生成障碍性贫血、苯丙酮尿症等，应用PCR扩增的DNA片段直接与相应寡核苷酸探针杂交（PCR／ASO），即可明确诊断突变的纯合子和杂合子。

（2）PCR／RFLP连锁分析。在人群中，DNA多态性可以改变限制酶的切割位点，产生DNA的RFLP。RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异，它按孟德尔方式遗传。在某一特定的家庭中，如果致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为遗传标记，来判断家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因。

当DNA多态性位点附近的DNA序列已知时，应用PCR可以简便地知道家庭成员中这些多态性位点的存在或丢失。通过连锁分析，即可对有遗传病风险的胎儿进行产前诊断和携带者检出。

（3）可变数目串联重复序列和短串联重复序列多态性分析。在人类基因组中存在一类DNA重复序列家族，其中有许多以一系列串联重复排列为特征，其重复单位为7～70bp的核苷酸序列，称为小卫星DNA或可变数目串联重复序列（variable number tandem repeats，VNTR）；另一类重复序列是微卫星DNA或短串联重复序列（short tandem repeat，STR），其基本序列长1～6bp，如（TA）_n、（CGG）_n等，重复次数在人群中是高度变异的。

STR、VNTR具有高度的变异性，按照孟德尔方式遗传，因此是很好的遗传标记。由于它们类型众多且在基因组中分布广泛，因而在基因连锁诊断中有重要的应用价值。特别是STR，可设计STR两侧DNA引物，进行PCR扩增，就可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨STR重复数（图14－1），由此进行连锁分析，可对一些突变类型不明的遗传病如血友病A、Duchenne型肌营养不良等进行基因诊断和产前诊断。

图14－1　一个STR多态性

由于大多数VNTR的重复区可长达数千bp，标准PCR很难扩增到如此长度，因此，VNTR通常需用DNA印迹分析。而STR可用PCR分析，具有高度多态性，更适合于大规模DNA分型。

（4）PCR／单链构象多态性诊断法。单链构象多态性（single strand conformation poly－morphism，SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小缺失或插入的检测。PCR结合SSCP检测基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，正常的DNA单链与基因突变的DNA单链显现出不同的带型，从而判断某个体是否存在特异的突变。PCR结合SSCP的主要优点是能经济、快速、灵敏地检测出有无点突变或多态性，并可同时检测多个样本，但该技术不能确定突变的部位和性质。如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。另外，随着DNA片段长度的增加，突变的检出率逐渐降低。

（5）PCR产物变性梯度凝胶电泳分析。变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel elec－trophoresis，DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100%，检测片段可达1kb，最适范围为100～600bp。基本原理是：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降；当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5′末端加一段长40～50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。该法一经建立，操作较简便，适合于大样本的检测筛选。

（6）变性高效液相色谱分析。变性高效液相色谱（denaturing high－performance liquid chromatograph，DHPLC）是近年来开发出的一种进行DNA分析的新技术，其原理是基于离子对反向液相色谱分析（ion－pair reversed phase high performance liquid chromatography，IPRP－HPLC）。在DNA部分变性的温度条件下，变异型和野生型的PCR产物分别形成同源双链和异源双链。由于异源双链与同源双链熔解温度（melting temperature，Tm）的差异，使色谱固定相保留它们的能力有所不同，这样根据柱上的保留时间可以分辨异源双链与同源双链（图14－2），从而识别变异型。此技术具有快速、敏感、准确且经济的特点，可用于临床遗传病的基因诊断。

图14－2　通过变性和复性产生的异源和同源双链及其对应的DHPLC检测结果示意图

3.DNA序列测定

DNA序列测定是诊断已知和未知突变基因最直接可靠的方法。PCR技术的应用，使DNA测序从过去的克隆后测序进入扩增产物直接测序的新阶段。更新的DNA自动测序仪采用4种不同颜色的荧光标记4种双脱氧核苷酸，测序操作已实现了自动化。DNA序列测定可对其他各种方法的诊断结果进一步验证，它是DNA序列分析的“金标准”。但对于待测基因较大、突变位点不固定或基因未知的情况，直接测序则难度较大或不可行。

4.DNA芯片

DNA芯片（DNA chip）是生物芯片的一种。它是把成千上万的寡核苷酸或DNA样品密集有序地排列于固相支持物（如玻片、硅片、尼龙膜等）上，通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，电脑软件分析处理资料，可对上千种甚至更多基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。

5.连锁分析

遗传病的基因诊断一般需要知道致病基因或相关基因，但是，很多遗传病的致病基因并不清楚，或者基因较大，跨度达数百到数千kb，而且基因突变种类多、分布广，采用直接检测突变的方法比较困难或复杂，在不要求知道基因的具体突变时，可采用连锁分析进行检测。

连锁是指同一染色体上相互靠近的基因一起遗传，而不是独立分配。连锁分析是通过基因与DNA标记之间是否紧密连锁来分析患者是否携带致病基因。在连锁分析时，常用DNA多态性作为标记，如RFLP、STR、SNP等。多态性位点在基因连锁分析中的应用价值取决于它与致病突变之间连锁的紧密程度及其杂合度。连锁越紧密，所得结果越可靠；杂合度越高，应用价值越大。衡量的标准是多态性信息量（polymorphism information content，PIC）。PIC是指某一家系可以利用多态性作为遗传标记进行基因连锁分析的概率，就群体而言，它是指在群体中利用这些多态性位点连锁分析进行基因诊断的诊断率。在有些情况下，只分析一个多态性座位尚不能将家系中的致病基因所在染色体与正常染色体区分开，必须分析多个座位的状态，以便获得足够的信息。一条染色体上两个或两个以上的多态性座位状态的组合称为单体型（haplotype）。

上述各种基因诊断方法在实际应用时可以根据不同的病种、不同的突变类型作合理选择（表14－2）。例如，如果遗传病是由于动态突变所致，可采用PCR及其相关技术和DNA印迹杂交来阐明有关基因的三核苷酸重复序列异常扩展的拷贝数，从而对该遗传病作出准确的诊断。

表14－2　遗传病的基因诊断方法

6.基因诊断举例

例1 α－珠蛋白生成障碍性贫血的基因诊断。

Southern印迹杂交技术是基因诊断的基本方法，首先由简悦威实验室用于α－珠蛋白生成障碍性贫血的基因诊断。限制酶（如BglⅡ等）能识别特定的α基因碱基序列，因而能特异性地把DNA切割成一定大小的片段（图14－3），通过琼脂糖凝胶电泳分离，然后用DNA印迹法把这些DNA片段转移到硝酸纤维素薄膜上，再与用同位素标记的特异基因探针进行DNA分子杂交，应用放射自显影技术，即能显示出相应的DNA片段（图14－4），从而鉴定其基因是否异常。

图14－3　BglⅡ在α－珠蛋白基因附近的切点及不同类型的缺失示意图

图14－4　α－珠蛋白基因缺失病例的BglⅡ酶切DNA印迹示意图

1、8：正常对照 2、5：东南亚缺失型α0－珠蛋白生成障碍性贫血杂合子（－－／αα）3：右侧缺失型HbH 4、7：Hb Bart’s胎儿 6：左侧缺失型HbH

例2 β－珠蛋白生成障碍性贫血的基因诊断。

由于β基因的结构和序列已清楚，故直接检测β^－珠蛋白生成障碍性贫血的基因突变是对β^－珠蛋白生成障碍性贫血进行基因诊断和产前诊断的最主要策略，而常用的技术之一是PCR／ASO探针分析。例如IVS2nt.654（C→T）的基因诊断，合成针对该位点的突变型探针及其相应正常基因的寡核苷酸（ASO）探针。

突变探针（M）：5′－ATTGCTATTACCTTAACCC－3′

正常探针（N）：5′－GGGTTAAGGCAATAGCAAT－3′

用放射性同位素（常用［γ－32P］ATP）作末端标记后，与PCR扩增的β基因片段进行杂交，放射自显影后就可明确诊断受检者的基因型（或是否为突变的纯合子）（图14－5）。如果PCR产物仅与N型探针杂交而不与M型探针杂交，说明β基因中不存在IVS2nt.654（C→T）突变；如果PCR产物仅与M型探针杂交而不与N型探针杂交，说明β基因具有纯合型IVS2nt.654（C→T）突变；如果PCR产物能同时与N型探针和M型探针杂交，说明β基因中具有杂合型IVS2nt.654（C→T）突变。

例3　遗传性耳聋的基因诊断。

图14－5　PCR／ASO探针检测IVS2nt.654（C→T）突变

间隙连接蛋白26（Cx26）基因（即GJB2基因）的突变是常染色体隐性遗传耳聋最主要的原因。在不同人群中，GJB2基因突变占所有语前耳聋病例的50%，其编码区235delC突变在我国较常见。采用PCR－RFLP方法可对遗传性耳聋进行基因诊断。PCR引物如下。

P1：5′－TGTGTGCATTCGTCTTTTCCAG－3′

P2：5′－GGTTCCTCATCCCTCTCAT－3′

扩增片段长度为785bp，覆盖Cx26基因全部编码区。PCR产物经ApaⅠ酶切后电泳即可明确个体的基因型（图14－6）。

图14－6　PCR产物经ApaⅠ消化后再经琼脂糖凝胶电泳，检测235delC突变

M：DNA marker 1：235delC纯合子 2：235delC杂合子 3：正常等位基因

二、症状前诊断

某些常染色体显性遗传病的杂合子个体往往发病年龄晚，如成年多囊肾病、亨廷顿舞蹈病等，好发年龄均在成年以后，因而可对有家族史的某些家庭成员在症状出现前作出基因诊断。

通过家系分析，已证实成年多囊肾病（adult polycystic kidney disease，APKD）的致病基因与α基因3′端附近的一段小卫星DNA序列即3′高度可变区（HVR）紧密连锁，而后者在人群中具有高度多态性，因此可通过RFLP连锁分析进行诊断。当用3′HVR作为探针与经PvuⅡ酶切后的家系有关成员的DNA杂交时，可见5.7kb、3.4kb和2.4kb三种等位片段（图14－7）。由图14－7可知致病基因与3.4kb等位片段连锁，因而Ⅱ₃不是致病基因携带者，Ⅱ₄则是致病基因携带者。应注意体检，发现肾病及时治疗。

图14－7　成年多囊肾病的连锁分析诊断

亨廷顿舞蹈病是一种常染色体显性遗传病，约20000人中累及1人。图14－8所示为一个亨廷顿舞蹈病家系。Ⅰ₁和Ⅱ₁已经发病，其他成员尚未得病，他们是否也携带致病基因呢？DNA分析可作出症状前诊断。患者和家系部分成员的DNA用HindⅢ酶切后与亨廷顿舞蹈病基因连锁G8探针进行分子杂交，检出A、B、C、D四种分子单体型（图14－9）。患者Ⅰ₁和Ⅱ₁共有分子单体型B（4.9kb、17.5kb），提示分子单体型B与亨廷顿舞蹈病基因连锁。分析家系中其他成员，Ⅱ₂、Ⅲ₁也含有分子单体型B，他们迟早会发病（在不发生重组的情况下），应尽快做好预防工作。

图14－8　一个亨廷顿舞蹈病家系部分成员症状前DNA分子单体型连锁分析诊断

三、产前诊断

产前诊断（prenatal diagnosis）是以羊膜穿刺术和绒毛取样术等技术为主要手段，对羊水、羊水细胞和绒毛膜细胞进行遗传学分析，以判断胎儿的染色体或基因等是否正常。如果确认胎儿具有严重的异常，可及时终止妊娠，避免严重遗传病患儿的出生，是预防遗传病的有效手段。遗传病的产前诊断可以追溯到1966年，Steele和Berg发现可以通过培养羊水细胞来制备胎儿的染色体。随着影像诊断、生化诊断和分子诊断的发展，产前诊断得到越来越广泛的应用。

图14－9　G8限制性片段长度多态性分析

（a）G8探针基因座示意图。这个RFLP同时检测HindⅢ两个多态位点。多态位点以“＊”标示，也列出了非变异位点。根据位点1或位点2是否存在，每条染色体可表现为四种不同的单体型A、B、C、D中的一种。探针的位置标在图的底部。使用这个探针进行DNA印迹杂交时无法观察到C、D单体型的2.5kb片段和A、C单体型的1.2kb片段

（b）图14－8中家系部分成员G8基因座DNA印迹杂交示意图

（一）产前诊断的对象

根据遗传病的严重程度和发病率的高低，将产前诊断的对象排列如下：

（1）夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或夫妇核型正常，但曾生育过染色体病患儿的孕妇；

（2）35岁以上的高龄孕妇；

（3）夫妇之一有开放性神经管畸形，或是生育过这种畸形儿的孕妇；

（4）夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇；

（5）X－连锁遗传病基因携带孕妇；

（6）有原因不明的习惯性流产史的孕妇；

（7）羊水过多的孕妇；

（8）夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；

（9）具有遗传病家族史，又是近亲结婚的孕妇等。

（二）产前诊断的方法与应用

产前诊断的常用方法包括非侵袭性方法（如B超、X线、CT和磁共振等）和侵袭性方法（如羊膜穿刺术、绒毛取样法、脐带穿刺法、胎儿镜检查等）。以下主要介绍羊膜穿刺术和绒毛取样法。

1.羊膜穿刺术

羊膜穿刺术（amniocentesis）是指在B超监视下，用消毒注射器抽取胎儿羊水的方法（图14－10）。取样的最佳时间在怀孕16～20周之间。此时羊水量较多，成功率高。羊膜穿刺的危险性相对较小，引起流产的风险约为0.5%。该法可用于诊断染色体病、遗传性代谢病、神经管缺陷（NTD）和遗传病的DNA检测。

图14－10　羊膜穿刺术

2.绒毛取样法

绒毛取样法（chorionic villus sampling，CVS）是指在B超的监视下，用一特制的塑料导管或金属导管从阴道经宫颈口进入子宫，再沿子宫壁到达预定的取样位置，吸取胎儿绒毛组织（图14－11）。绒毛组织中含有大量的处于分裂期的细胞，可以用来直接制备染色体，或经短期培养后制备染色体；也可以直接用于生物化学分析和分子诊断。该方法的优点是可以在妊娠早期（9～12周）进行，需要作出选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦较小。缺点是引起流产的风险比较高，是羊膜穿刺的两倍，而且标本容易被细菌、霉菌污染，不宜进行长期培养。

图14－11　绒毛取样法