结缔组织染色

学习目标

◆熟悉常规染色的基本原理。

◆会配制常规染色试剂。

◆会用HE染色试剂染组织片。

◆掌握常规染色的结果及注意事项。

任务描述

组织切片染色技术是病理学检验技术中极为重要的一门技术，良好的切片染色可以为病理诊断及科研提供极其重要的帮助。每一位优秀的技术员都应该熟练掌握组织切片染色技术。

组织切片染色就是利用染料对组织切片予以处理，使其与组织或细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，以利于显微镜观察。

组织切片染色技术根据染色方法的不同分为：

1.常规染色技术　习惯上将苏木精-伊红染色（HE染色）称之为常规染色，是目前细胞和组织中应用最广泛的染色方法。病理细胞和组织学的诊断、教学和研究都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。

2.特殊染色技术　特殊染色是指为显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等进行的染色方法。

3.免疫组织化学技术　是利用抗原与抗体之间的特异性结合原理和特殊标记技术，对细胞和组织内的特定抗原或抗体进行定位、定性或定量检测的一门技术。

常规染色技术即苏木精-伊红染色，简称HE染色，是石蜡切片技术里最常用、最基本的染色方法。

1.细胞核染色的原理　细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸即DNA，DNA两条双螺旋结构链上的磷酸带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料及离子键或氢键相结合而被染色。苏木精染料呈紫蓝色，故细胞核呈紫蓝色。

2.细胞质染色的原理　细胞质内的主要成分是蛋白质，为两性化合物，细胞质的染色与pH值有密切关系，当pH值调至6.7～6.8，大于蛋白质的等电点时，表现为酸性电离，此时带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，同时胞核也被染色，胞核胞质难以区分，因此，必须把pH值调至细胞质等电点以下。在伊红染液中加入醋酸，在水中解离成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷结合而使细胞质染色，细胞质、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染料染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

3.二甲苯的作用　石蜡切片染色前必须先用二甲苯脱去切片中的石蜡，以利于染料进入细胞和组织，另外，染色后二甲苯起透明作用，以利于光线透过。

4.乙醇的作用　将组织切片从高浓度向低浓度乙醇逐渐下降处理是为了洗去脱蜡时的二甲苯，使水能进入细胞和组织中；再经过95%、80%乙醇使水分逐渐进入切片，以免引起细胞形态结构的人工改变；伊红染色后由低浓度向高浓度逐渐过渡是为了逐渐脱去组织中的水分。

5.水洗的作用　组织切片经乙醇脱蜡处理之后水洗切片，使水进入组织细胞中，便于苏木精染液进入细胞核中使之染色。染色后水洗是为了洗去未与组织结合的染液。分化后的水洗是为了除去分化液和脱下的染料，终止分化作用。伊红染色之后的水洗是洗去未与组织结合的染液，防止伊红染液进入脱水的乙醇中。

6.分化作用　苏木精染色后，用1%盐酸乙醇分化液处理，是为了脱去细胞核中结合过多和细胞质中吸附的染料，保证细胞核和细胞质染色分明，这个过程称之为分化。

7.蓝化作用　分化之后苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，在碱性条件下则处于蓝色离子状态，而呈蓝色。所以分化之后用水洗除去酸而中止分化，再用弱碱性水使苏木精染上的细胞核变成蓝色，称蓝化作用，一般多用自来水蓝化。

1．苏木精染液　苏木精是一种纯天然的染料，是从苏木树中提炼出来的，纯的苏木精染色性能较差，现多采用苏木精配方染液，染色性能好，保持时间长，是常规细胞核染料。苏木精的配方很多，可根据不同需要选择合适染剂，Harris配方最为常用。

（1）Harris，苏木精染液　主要应用于一般组织和细胞学染色。

苏木精1g

无水乙醇　　　　　10mL

硫酸铝钾　　　　　20g

蒸馏水　　　　　　200mL

氧化汞　　　　　　0.5g

冰醋酸　　　　　　8mL

先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾；然后将该两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。

（2）Gill改良苏木精液　主要应用于一般组织和骨组织染色。

苏木精　　　　　2g

无水乙醇　　　　250mL

硫酸铝钾　　　　17g

蒸馏水　　　　　750mL

碘酸钠　　　　　0.2g

冰醋酸　　　　　20mL

先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水溶解硫酸铝钾；然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。使用前过滤。

（3）Mayer改良苏木精液

A液：苏木精　　　　2g

无水乙醇　　　　　 40mL

B液：硫酸铝钾　　　100g

蒸馏水　　　　　　 600mL

将苏木精溶于无水乙醇中（A液）；稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B液）。将A液与B液混合后煮沸2min，再用蒸馏水补足至600mL，加入400 mg碘化钠充分混匀。染液呈紫红色。

2.盐酸-乙醇分化液

浓盐酸　　　　1mL

70%乙醇　　　 99mL

此液用一段时间后需要适当延长分化时间或更换新液体，新配置的分化液分化时间应缩短。

3.伊红液　伊红是一种红色酸性染料，常用于上皮细胞、肌肉纤维和细胞质染色。

（1）0.25%～0.5%伊红Y水溶液

伊红Y　　　　　0.25～0.5g

蒸馏水　　　　 100mL

冰醋酸1滴

（2）0.5%伊红Y-氯化钙水溶液

伊红Y　　　　　0.5g

蒸馏水　　　　 100mL

无水氯化钙0.5g

（3）0.25～0.5%伊红Y-乙醇溶液

伊红Y　　　　　　0.25～0.5g

80%乙醇　　　　　100mL

4．苯酚-二甲苯混合液

苯酚　　　　　1份

二甲苯　　　　3份

（一）人工操作苏木精-伊红染色方法

1.二甲苯Ⅰ　　　　　　　　　　5～10min

2.二甲苯Ⅱ　　　　　　　　　　5～10min

3.无水乙醇Ⅰ　　　　　　　　　1～3min

4.无水乙醇Ⅱ　　　　　　　　　1～3min

5.95%乙醇Ⅰ　　　　　　　　　 1～3min

6.95%乙醇Ⅱ　　　　　　　　　 1～3min

7.80%乙醇　　　　　　　　　　 1min

8.蒸馏水　　　　　　　　　　　1min

9.苏木精液染色　　　　　　　　5～10min

10.流水洗去苏木精液　　　　　 1min

11.1%盐酸-乙醇　　　　　　　　1～3 s

12.稍水洗　　　　　　　　　　 1～2 s

13.返蓝（用温水或1%氨水等）　 5～10 s

14.流水冲洗　　　　　　　　　 1～2min

15.蒸馏水洗　　　　　　　　　 1～2min

16.0.5%伊红液染色　　　　　　 1～3min

17.蒸馏水稍洗　　　　　　　　 1～2 s

18.80%乙醇　　　　　　　　　　1～2 s

19.95%乙醇Ⅰ　　　　　　　　　2～3min

20.95%乙醇Ⅱ　　　　　　　　　2～3min

21.无水乙醇Ⅰ　　　　　　　　 3～5min

22.无水乙醇Ⅱ　　　　　　　　 3～5min

23.苯酚-二甲苯　　　　　　　　3～5min

24.二甲苯Ⅰ　　　　　　　　　 3～5min

25.二甲苯Ⅱ　　　　　　　　　 3～5min

26.二甲苯Ⅲ　　　　　　　　　 3～5min

27.中性树胶封固

注：第12和13项可省去，但14的冲水时间需延长至10～15min，使细胞核显示更清晰。

第23项可用无水乙醇代替亦可省略。

（二）自动染色机苏木精-伊红染色步骤

1.二甲苯Ⅰ　　　　　　　　　　　　10min

2.二甲苯Ⅱ　　　　　　　　　　　　10min

3.无水乙醇Ⅰ　　　　　　　　　　　1min

4.无水乙醇Ⅱ　　　　　　　　　　　1min

5.95%乙醇Ⅰ　　 　　　　　　　　　1min

6.95%乙醇Ⅱ　　 　　　　　　　　　1min

7.80%乙醇　　　 　　　　　　　　　1min

8.蒸馏水　　　　　　　　　　　　　1min

9.苏木精液染色　　　　　　　　　　1～5min

10.蒸馏水洗　　 　　　　　　　　　1min

11.1%盐酸-乙醇分化　　　　　　　　30 s

12.返蓝（用温水或1%氨水等）　　　 5min

13.0.5%伊红液染色　　　　　　　　 0.5～5min

14.蒸馏水稍洗　　　　　　　　　　 30 s

15.80%乙醇　　　　　　　　　　　　20 s

16.95%乙醇Ⅰ　　　　　　　　　　　1min

17.95%乙醇Ⅱ　　　　　　　　　　　1min

18.无水乙醇Ⅰ　　　　　　　　　　 2min

19.无水乙醇Ⅱ　　　　　　　　　　 2min

20.二甲苯Ⅰ　　　　　　　　　　　 2min

21.二甲苯Ⅱ　　　　　　　　　　　 2min

22.二甲苯Ⅲ　　　　　　　　　　　 2min

23.中性树胶封固

（三）冰冻切片HE染色

1.冰冻切片固定　　　　　　　10～30 s

2.稍水洗　　　　　　　　　　1～2 s

3.苏木精液染色（60 ℃）　　 30～60 s

4.流水洗去苏木精液　　　　　5～10 s

5.1%盐酸-乙醇　　　　　　　 1～3 s

6.稍水洗　　　　　　　　　　1～2min

7.返蓝（用温水或1%氨水等）　5～10 s

8.流水冲洗　　　　　　　　　15～30 s

9.0.5%伊红液染色　　　　　　1～2min

10.蒸馏水稍洗　　　　　　　 1～2min

11.80%乙醇　　　　　　　　　1～2min

12.95%乙醇　　　　　　　　　1～2min

13.无水乙醇Ⅰ　　　　　　　 1～2min

14.无水乙醇Ⅱ　　　　　　　 1～2min

15.苯酚-二甲苯　　　　　　　2～3min

16.二甲苯Ⅰ　　　　　　　　 2～3min

17.二甲苯Ⅱ　　　　　　　　 2～3min

18.中性树胶封固

注：第7和8项可省去，但9的冲水时间需延长至10～15min，使细胞核显示更清晰。

第15项可用无水乙醇代替亦可省略。

细胞核、黏液、软骨和各种微生物被染成蓝色、深蓝色。

细胞质呈淡红色，胶原纤维呈淡粉红色，细胞质内嗜酸性颗粒呈鲜红色，红细胞呈淡红色。

1.脱蜡　石蜡切片染色前必须经过脱蜡程序，脱蜡不净是影响染色不良的常见原因。脱蜡之前要经过恒温箱烘烤，使组织与切片粘贴牢固，脱蜡的时间主要取决于二甲苯的温度和应用时间，如二甲苯已应用较长时间，切片较厚，室温较低，则应延长脱蜡时间。

2.染色　染色过程要注意苏木精染液应用时间，切片的多少，相应增加或缩短染色时间，苏木精易被氧化，染色前应漂去氧化膜，避免大量苏木精染料沉渣附着。切片的分化程度应在镜下观察，如分化过度，应水洗后重新在苏木精中染色，再进行分化返蓝步骤。新配制的伊红染液染色时间不宜过长，染色后切片水洗时间要短。

3.脱水　切片经过染色后，通过各级乙醇脱水，先从低浓度到高浓度，低浓度乙醇对伊红有分化作用，切片经过低浓度乙醇时间要短，向高浓度时逐步延长脱水时间，脱水不彻底，使切片发雾，不便于观察组织细微结构。

4.透明与封片　石蜡切片染色后经过脱水后必须经过二甲苯处理，使切片透明，才可封片。封片时，树胶不能太稀或太稠，滴加量要适宜，过稀或过少容易出现气泡，过多则使树胶溢出。

常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准见表3-1。

表3-1　常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准

思考题

1.HE染色剂基本原理？

2.HE染色的方法？

3.HE染色试剂的配制？

学习目标

◆了解特殊染色的应用。

◆了解特殊染色染液的配制。

◆熟悉常用特殊染色的操作流程。

◆熟悉特殊染色的注意事项。

任务描述

特殊染色可显示组织或细胞中的特殊成分，是常规染色的重要补充，并且具有操作简便、用时较短、费用较低等优点，在病理检验技术中占有重要地位。在基层医院中发挥着重要的应用价值。

为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色，称之为特殊染色。特殊染色作为常规染色的重要补充，能显示常规切片中不明显或不能着色的病变或物质，与组织化学相比操作简便、所需时间短、费用较低。因此，在基层医院的病理检验中，特殊染色拥有着重要的价值。下面介绍几种常用的特殊染色技术。

结缔组织广泛分布于人体和动物体内，由细胞和大量细胞间质构成，具有连接、支持、营养、保护等多种功能。细胞间质包括纤维组织和基质，纤维组织包括胶原纤维、弹性纤维和网状纤维。可以通过特殊染色对三种纤维组织加以鉴别。

（一）胶原纤维

胶原纤维主要是由成纤维细胞产生的一种胶原蛋白铰链而成，此种纤维在HE染色中显示浅红色，粗细不等，难以与其他纤维鉴别。胶原纤维染色可予以准确鉴别胶原纤维，鉴定肿瘤组织来源，并根据纤维多少评估心肌瘢痕灶、早期肝硬化等疾病的严重程度。

1.苦味酸-酸性品红法

（1）试剂配制

1）Weigert氏铁苏木精染液

A液：苏木精　　　　　　1g

无水乙醇　　　　　　　 100mL

B液：30％三氯化铁液　　4mL

蒸馏水　　　　　　　　 100mL

纯盐酸　　　　　　　　 1mL

A、B两液需分瓶盛放，A液配制后数内可用，不宜配制过多，如保存时间过长则染色不良。平时应密封保存，B液配制后立即可用。临用前将A、B两液等量混合。

2）Vangieson染液

A液：1％酸性品红水溶液

B液：苦味酸饱和水溶液（约1.2％）

A、B两液分瓶盛放。临用前取A液1份，B液9份混合后使用。

（2）染色步骤　①组织固定于10％中性甲醛，常规脱水包埋及切片；②切片脱蜡至水；③用Weigert铁苏木精液染5～10min；④流水稍洗；⑤1％盐酸乙醇迅速分化；⑥流水冲洗数分钟；⑦用Vangieson液染1～2min；⑧倾去染液，直接用95％乙醇分化和脱水（可放入温箱烤干后，直接透明封片）；⑨无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

结果:胶原纤维呈鲜红色，肌纤维，胞质及红细胞呈黄色，胞核呈蓝褐色。

2.天狼星红-饱和苦味酸液

（1）试剂配制

1）天狼星红饱和苦味酸液

0.5%天狼星红　　　　　　　10mL

苦味酸饱和液　　　　　　　90mL

2）天青石蓝液

天青石蓝液B　　　　　　　　1.25g

铁明矾　　　　　　　　　　 1.25g

蒸馏水　　　　　　　　　　 250mL

混合均匀后溶解煮沸，冷却后过滤，加入甘油30mL，最后加入浓硫酸0.5mL。

（2）染色步骤　①中性甲醛固定组织，常规脱水包埋及切片；②加入天青石蓝染液染5～10min；③蒸馏水洗3次；④天狼星红饱和苦味酸染15～30min；⑤无水乙醇直接分化与脱水；⑥二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：胶原纤维呈红色，细胞核呈绿色，其他呈黄色。

（3）注意事项　①细胞核复染色可以用Harris苏木精染液淡染。②染色封固后的切片，必须及时用偏光显微镜仔细观察和照相，保持鲜艳的色彩；在偏光显微镜下可以观察到四种类型的胶原纤维。

Ⅰ型胶原纤维：紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色分布。

Ⅱ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布。

Ⅲ型胶原纤维：显示弱的折光性，呈绿色的细纤维。

Ⅳ型胶原纤维：显示弱的双折光，呈淡黄色。

（二）网状纤维染色

网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维，由交错排列的纤维组成，大量纤维堆积时则形成致密的网状，故称之为网状纤维。常规HE染色着色很浅，不易辨认，可以通过网状纤维染色加以鉴别。网状纤维染色的基本原理是氨银液被组织吸附与组织中的蛋白结合，经甲醛还原成黑色的金属银沉积于组织内及表面。用氯化金调色后，再用硫代硫酸钠液洗去未还原的银盐，从而将组织内的网状纤维清晰地显示出来。

网状纤维染色常用于区别上皮还是非上皮来源的恶性肿瘤、血管内皮细胞瘤或外皮细胞瘤、恶性淋巴瘤及组织细胞肉瘤、骨异质增生及骨化性纤维瘤、黏液纤维瘤及黏液肉瘤、脑膜瘤及星形细胞瘤。

网状纤维染色方法有Gomori法、Godon and Sweet法、Wilder法、Foot法。主要介绍Gomori法。

1.染液配制　Gomori银染液：取10%硝酸银3份，10%的氢氧化钾1份，混合后产生大量的黑色沉淀物，倒去表面的液体，保留下沉淀物，加入10～20倍或更多的蒸馏水进行冲洗，连续冲洗3次。待沉淀物清晰则可。用浓氨水逐滴加到溶液中，使沉淀物逐步溶解。待见沉淀物剩少数几粒时，再取10%的硝酸银液加入数滴，至溶液再现浑浊为止。再用氨水将其溶解，然后稀释10～15倍。即可使用。平时保存于4 ℃冰箱中。

2.染色步骤　①切片脱蜡至水，蒸馏水洗；②用0.5%高锰酸钾氧化5min；③自来水洗，继用蒸馏水洗；④用2%草酸漂白切片2min；⑤自来水洗，蒸馏水洗；⑥2%硫酸铁铵媒染5min；⑦水洗，蒸馏水洗；⑧滴入氨性银溶液浸染3～5min；⑨蒸馏水洗数次；⑩10%甲醛液还原5～10min；水洗2min；用核固红染色10～15min；水洗10min，各级乙醇脱水；常规透明，中性树胶封固。

染色结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈红色，背景呈黄色。

3.注意事项　①所使用的玻璃器皿须用清洁液处理。②配制氨银溶液时，氨水加入的量要适宜，过多会引起反应下降，使液体过碱，染色时切片容易脱落。过少则引起感应上升，浸染效果不佳，不好掌握。③配制氨银液时，有可能用玻璃器皿盛蒸馏水。④切片氧化漂白应彻底，不能使残存的甲醛留于片上，否则将导致过早还原而使浸染不均匀。⑤尽可能使用涂胶的载片，以增加附贴性防止脱片。⑥如有可能，氨银溶液以新配为佳，但也可保存于4 ℃冰箱中达1个月左右，此液体易挥发，用后即须盖紧，如有沉淀产生则应抛弃。

（三）弹性纤维染色

弹性纤维是一种凝胶，主要成分为含大量二硫键的糖蛋白，主要分布于呼吸道、血管壁和皮肤真皮；呈强嗜碱性，易于染色液中的碱基结合，在镜下具有折光性，经染色很容易辨认。

弹性纤维染色常用于皮肤组织增生和变化；呼吸道的支气管扩张；老年肺气肿的纤维断裂、变性或萎缩；心血管的心内膜弹性纤维异常增生症和高血压小动脉的异常增生，动脉粥样硬化弹性纤维的崩解、断裂与消失；肾组织和肿瘤中的纤维病变。

1.醛复红染色法

（1）染液配制

1）醛复红染液：碱性复红0.5g，浓盐酸1mL，70%乙醇100mL，三聚甲醛1mL。将碱性复红溶于70%乙醇，再加入浓盐酸和三聚甲醛，轻轻摇动使混合均匀，于室温下静置1～2 d，待变为紫色即为成熟，冰冻保存。

2）橘黄G染液：橘黄G 2g，蒸馏水100mL，磷钨酸5g。

3）Lougol碘液：碘片1g，碘化钾2g，蒸馏水100mL。

先取碘化钾溶于20mL蒸馏水中，再加入碘片，震荡至碘片溶解再把余下的蒸馏水加入。

将上述物质混合后震荡数分钟，使之溶解，静置一夜，取上清液使用。

（2）染色步骤

1）切片脱蜡；

2）用Lugol碘液处理5min；

3）水洗；

4）5%硫代硫酸钠溶液处理5min；

5)流水冲洗5min；

6）入70%乙醇；

7）入醛复红液10min；

8）70%乙醇洗2次；

9）水洗；

10）橘黄G液滴染1 s；

11）蒸馏水洗1min；

12）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：弹性纤维呈紫色，底色为不同程度的黄色。

2.弹性、胶原纤维双重组合染色法　弹性、胶原纤维双重组合染色方法，能鲜明地显示出弹性纤维和胶原纤维。具有染色方法简单，容易掌握，染色结果使两种纤维对比色彩鲜艳和清晰，并在较长的时间内不褪色等优点。所用的染液为维多利亚蓝染液和丽春红染色。

（1）染液配制

1）维多利亚蓝染液

维多利亚蓝　　　　　　2g

糊精　　　　　　　　　0.5g

间苯二酚　　　　　　　4g

蒸馏水　　　　　　　　200mL

将上述物质混合均匀后煮沸，边搅拌边煮约5min。然后，取另一容器盛30%三氯化铁溶液25mL，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合物中，煮沸约3min，其间不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸放在60 ℃恒温烤箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再溶于400mL 70%乙醇中，再加入浓盐酸4mL和苯酚5g，至成熟后使用。

2）丽春红-S染液

0.5%丽春红-S　　　　　　　15mL

苦味酸饱和水溶液　　　　　85mL

（2）染色步骤　①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；②切片入70%乙醇中洗2min；③将切片侵入呈有维多利亚蓝染液中染0.5～2 h；④直接入95%乙醇中分色数秒；⑤侵入蒸馏水洗2min；⑥用丽春红-S染液滴染切片2次；⑦直接用无水乙醇冲洗多余染液2次；⑧将切片在空气中干燥；⑨二甲苯透明，中性树胶封固。

染色结果：弹性纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。

（3）注意事项　①维多利亚蓝染液可多次使用，效果不减，溶液在室温中保存即可；②维多拉亚蓝染液在乙醇中分色后，要立即侵入水中，此后在镜下观察纤维的深浅度，如较深可继续分色；③丽春红-S染液染色后要及时用乙醇冲洗，稍干燥即透明封固，防止过于干燥形成黑色颗粒。

3.胶原、网状、弹性纤维三联染色法　用于判定各种组织、器官的病变程度与修复情况，鉴别梭形细胞软组织肿瘤的来源。下面主要介绍Masson三色染色法。

（1）试液配制

1）丽春红酸性品红液

丽春红　　　　　0.7g

酸性品红　　　　0.3g

蒸馏水　　　　　99mL

冰醋酸　　　　　1mL

2）苯胺蓝液

苯胺蓝　　　　　2g

蒸馏水　　　　　98mL

醋酸　　　　　　2mL

3）亮绿液

亮绿　　　　　　0.2g

蒸馏水　　　　　100mL

冰醋酸　　　　　0.2mL

（2）染色方法　①中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；②浸入Masson复合染液5min；③0.2%醋酸水溶液冲洗；④5%磷钨酸5～10min；⑤0.2%醋酸水溶液浸洗 2次；⑥浸入2%苯胺蓝液5min；⑦0.2%醋酸水溶液水洗2次；⑧无水乙醇脱水；⑨二甲苯透明，中性树胶封固。

（3）染色结果　胶原纤维、黏液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，胞核染蓝黑色。

（4）注意事项　①组织用Bouin液或Zenker液固定为佳，如已用10%甲醛液固定，切片可在脱蜡至水后，再放入Bouin液室温过夜或置37 ℃温箱内1～2 h，然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色；②磷钼酸处理时，要镜下控制，见肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色即可。

糖类通常分为三类：多糖、中性黏液物质和酸性黏液物质。广泛分布于心、肝、骨骼肌、毛囊等许多器官组织内。糖原的常规染色是过碘酸-Schiff（PAS）染色法。基本原理：过碘酸把存在于组织中的双碳键形式存在的乙二醇基断裂开，使其转变为双醛，其他的物质如氨基或烷基胺的衍生物也可以被转化为双醛，它们与试剂Schiff结合后产生了一种络合物，经过亚硫酸和二氧化硫的作用，成为无色复红，在经过氧化后的醛基与无色复红进行结合成紫红色。

常用于证实常规染色中胞质内的空泡是糖原还是脂肪被溶解形成；在心肌病变和心血管疾病中，用以观察缺血早期心肌坏死或梗死区的糖原减少；糖原积累疾病和糖尿病器官、组织、细胞中的糖原颗粒沉着；肿瘤组织中的肝细胞癌；横纹肌、平滑肌和软骨肉瘤；汗腺瘤和化学感受器等，均有糖原的存在。

1.过碘酸-Schiff（PAS）染色法

1）过碘酸氧化液

过碘酸　　0.5g

蒸馏水　　100mL

此溶液溶解后保存在冰箱中待用。

2）Schiff液

碱性品红1g

1 mol/L盐酸　　20mL

重亚硫酸钠　　2g

重蒸馏水　　　200mL

先将200mL重蒸馏水煮沸，调小火焰，加入1g碱性品红，再煮沸1min。冷却到50 ℃加入1 mol/L盐酸20mL，待35 ℃时加入2g重亚硫酸钠。室温中2 h之后稍带红色，5 h后变为无色液体。盛装在棕色瓶内，封口，放入冰箱中保存使用。

2.染色步骤　①用Carony固定液或无水乙醇固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水；②蒸馏水洗；③高碘酸氧化液作用10～20min；④用蒸馏水漂洗1～2min；⑤移入Schiff染液中作用15～30min，盖片样品稍稍变红；⑥用自来水漂洗5～10min，盖片样品变红；⑦用蒸馏水反复冲洗；⑧明矾苏木精浅染细胞核3～5min；⑨盐酸分化，流水冲洗后细胞核变蓝为止；⑩用无水乙醇逐级脱水各2min；用二甲苯透明，用中性树脂封片后观察。

3.染色结果　糖原及其他PAS反应的阳性物质呈红色，细胞核呈蓝色。

4.注意事项　①进行糖原染色的组织块尽可能小，以免固定不良出现糖原颗粒趋于细胞一端情况；②配制Schiff试剂要用质量优良的重亚硫酸钠；③染色前将Schiff试剂取出后，适应室温后再进行染色，室温在15 ℃以下可用40 ℃温水稍加温进行反应。

脂质包括脂肪和类脂（磷脂、糖脂、固醇脂等），它是构成人体组织的重要成分，主要存在于皮下网膜和肠系膜，主要功能是氧化供能。脂肪染色主要用于鉴别细胞内的空泡性质，显示动脉粥样硬化斑块病灶内的脂质沉积、脂肪栓塞；还用于卵泡膜细胞瘤、肾母细胞癌、皮脂腺癌等疾病的鉴别诊断。常用的脂肪染色方法包括：油红O染色法、锇酸脂肪染色。下面主要介绍油红O染色。

1.试剂

油红O染液

油红O　　　　　0.5g

异丙醇　　　　 100mL

油红O完全溶于异丙醇后过滤。用时取原液6mL，加蒸馏水4mL稀释，静置5～10min后使用。此液保存不超过2 h。

2.染色步骤　①将冰冻切片厚度为4～8 μm；②4%甲醛固定10～30min；③蒸馏水洗；④侵入油红溶液10～15min；⑤60%乙醇分化至基质清晰；⑥蒸馏水洗；⑦苏木精染1～1.5min；⑧流水冲洗返蓝；⑨甘油明胶封片。

3.染色结果　脂质呈鲜红色，细胞核淡蓝色。

4.注意事项　①染色时尽可能使用密闭器皿，防止染液沉淀；②可将苏木精液等量稀释后使用效果较好。

神经组织主要包括神经细胞及神经胶质细胞，常规HE染色难以显示神经组织的一般结构。神经组织染色可显示尼氏体、神经纤维及髓鞘，用于观察神经系统病变。

（一）尼氏体染色

尼氏体存在于神经细胞内，尼氏体的存在或减少，表示神经细胞的正常或异常状态。常用的染色方法包括：甲苯胺蓝染色法、焦油紫染色法、Einarson棓酸青蓝染色法，下面主要介绍甲苯胺蓝染色法。

1.试剂

1%甲苯胺蓝水溶液

甲苯胺蓝1g

蒸馏水100mL

2.染色步骤　①中性甲醛固定，常规石蜡切片，脱蜡至水；②放入预热50～60 ℃的1%甲苯胺蓝水溶液中，浸染20～40min；③蒸馏水洗；④95%乙醇脱水；⑤二甲苯透明，中性树胶封片。

3.染色结果　尼氏体呈紫蓝色，细胞核呈棕红色。

4.注意事项　①组织切片厚度要适宜，一般6～8 μm；②95%乙醇分化时，可在镜下控制，以尼氏体显示清晰为止。

（二）神经纤维染色

神经纤维是由神经元的轴突或长的树突及包裹在轴突外的髓鞘构成。神经纤维染色方法包括：Holmes神经纤维染色法、Bielschowsky神经纤维染色法、VonBraunmubl神经纤维、扣结、老年斑染色方法。下面介绍Holmes神经纤维染色法。

1.试剂

（1）缓冲液A

硼酸　　　　　12.4g

蒸馏水　　　　1 000mL

（2）缓冲液B

硼酸　　　　19.0g

蒸馏水　　　1 000mL

（3）浸润液

缓冲液A　　　55mL

缓冲液B　　　45mL

1%硝酸银　　 1mL

10%吡啶　　　5mL

蒸馏水　　　 394mL

（4）还原液

对苯二酚　　　1g

硫酸钠　　　　10g

蒸馏水　　　　100mL

还原液可反复使用，但保存超过1周即失效。

2.染色方法　①常规石蜡切片，一般厚度≥20 μm，脱蜡；②浸20%硝酸银，室温，避光，作用时间≥2 h，亦可过夜；③3次更换蒸馏水洗10min；④浸润液12 h 37 ℃液体量不少于20mL，容器密盖；⑤吸干，如还原液2min；⑥自来水洗3min，转入蒸馏水洗；⑦0.2%氯化金调色3min，至切片不显棕色为止；⑧蒸馏水洗1min；⑨移入2%草酸，镜下观察轴索及背景区分明显为止；⑩蒸馏水洗1min；5%硫代硫酸钠固定5min；自来水洗2min；乙醇脱水，透明，封固。

3.染色结果　神经纤维呈黑色，背景呈灰黑色。

病原微生物包括细菌、真菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体和病毒等。病原微生物染色对感染性疾病的诊断有着重要意义。

（一）真菌染色

真菌种类繁多，常见的致病菌有毛霉菌、曲霉菌、新型隐球菌、放线菌和白色念珠菌。其基本结构是黏多糖和蛋白质。下面介绍过碘酸-Schiff（PAS）染色法。

1.染液配制

（1）高碘酸氧化液　高碘酸0.5g，蒸馏水100mL。此液溶解后保存于冰箱中待用。

（2）Schiff液　酸性品红1g，1 mol/L盐酸20mL，重亚硫酸钠2g，重蒸馏水200mL。先将200mL重蒸馏水煮沸，调小火焰，加入1g酸性品红，再煮沸1min。冷却到50 ℃加入1 mol/L盐酸20mL，待35 ℃加入2g重亚硫酸钠。室温中2 h后见稍带红色，5 h后变为无色。盛在棕色瓶内，冰箱保存。

2.染色步骤　①用Carony固定液或无水乙醇液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡；②蒸馏水洗；③高碘酸氧化液10～20min；④蒸馏水洗2次；⑤Schiff液染色10min；⑥流水冲洗5min；⑦用Mayer或Harris明矾苏木精液染细胞核2～3min；⑧0.5%盐酸乙醇分化，自来水冲洗后将细胞核变蓝为止；⑨脱水，透明，封固。

3.染色结果　真菌及糖原呈红色，细胞核呈蓝色。

（二）细菌染色

细菌是常见的一种病原微生物，根据染色方法可分为一般细菌和抗酸杆菌两大类。一般细菌采用革兰氏染色法，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

1.Gram碱性复红结晶紫染色法

（1）试剂

1）苯胺油苯酚复红液

碱性复红　　　　0.5g

苯胺油　　　　　1mL

苯酚　　　　　　1g

30%乙醇70mL

碱性复红溶于70mL乙醇中，加热至90 ℃，冷却后再加苯酚及苯胺油。

2）碘液

碘片　　　　　1g

碘化钾　　　　2g

蒸馏水　　　　300mL

3）结晶紫染液

结晶紫　　　　2g

草酸铵　　　　1g

蒸馏水　　　　80mL

95%乙醇　　　 20mL

结晶紫溶于乙醇，草酸铵溶于蒸馏水，二液混合，置于冰箱中保存。

（2）染色步骤　①中性甲醛固定组织，常规切片，脱蜡；②苯胺油苯酚复红液5min；③流水冲洗后用蒸馏水洗净；④4%甲醛1min，蒸馏水洗2次；⑤苦味酸饱和液处理2min；⑥经过95%乙醇速洗后，放入自来水中立即变红色；⑦自来水冲洗，洗结晶紫液中染2min；⑧流水冲洗后用蒸馏水洗净；⑨碘液作用2min，用水洗后，直接用滤纸吸干；⑩二甲苯、苯胺油等分混合后，进行分化；二甲苯透明，中性树胶封片。

（3）染色结果　革兰氏阳性细菌呈蓝色，革兰氏阴性细菌呈红色；细胞核呈红色。

2.Ziehl-Neelsen抗酸杆菌染色法

（1）试剂

苯酚复红液

碱性复红　　　　1g

无水乙醇　　　　10mL

5%苯酚水溶液100mL

碱性复红溶于乙醇内，然后与苯酚水溶液相混合，用前过滤。

（2）染色步骤　①中性甲醛固定，常规切片脱蜡至水；②入苯酚复红液1 h；③自来水洗；④用0.5%盐酸乙醇分化数秒；⑤水洗，用0.1%亚甲蓝水溶液复染2min；⑥用95%乙醇分化，使亚甲蓝脱色，显示清楚；⑦无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

3.染色结果　抗酸杆菌呈红色，背景呈灰蓝色。

思考题

1．结缔组织染色有哪些、染色结果是什么？

2．糖原染色的操作方法及染色结果是什么？

免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。

（一）免疫组化的基本原理

免疫组织化学利用抗体和抗原之间的结合具有高度特异性这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去检测组织或细胞中同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位或定量的研究。

（二）免疫组织化学技术的分类

1.根据染色方式分类

（1）贴片染色。

（2）漂浮染色。

2.根据抗原抗体结合方式分类

（1）直接法。

（2）间接法。

（3）多层法。

3.按标记物的性质分类

（1）免疫荧光化学技术。

（2）免疫酶细胞化学技术。

（3）亲和免疫组织化学技术。

（4）免疫金属技术（免疫铁蛋白法、免疫金染色法、蛋白A金法）。

（三）免疫组织化学技术的特点

1.特异性强　免疫组化的作用原理抗原抗体反应具有高度特异性，所应用的抗体是特异性强的多价或单价抗体，具有高度的抗原识别能力，如角蛋白显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。

2.敏感性高　随着免疫组化技术的发展使细胞和组织内的待检物质的抗原性得到最大限度的保留或采用各种增敏方法，使的抗体可以和极其微量的抗原发生抗原抗体反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3.定位准确、形态与功能相结合　该技术通过抗原抗体反应及显色反应，可对组织和细胞中的抗原进行准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学的深入研究具有重要意义。

（四）免疫组织化学染色程序

1.石蜡切片脱蜡。

2.灭活内源性过氧化物酶，缓冲液冲洗。

3.非免疫血清封闭孵育。

4.抗原修复，缓冲液洗涤。

5.加一抗，孵育，缓冲液洗涤。

6.加二抗，孵育，缓冲液洗涤。

7.加酶结合物，孵育，缓冲液洗涤。

8.加酶底物，显色，衬染。

9.脱水、透明、封固，诊断。

（五）免疫组化在病理诊断中的意义

1.对肿瘤组织起源进行鉴别分析和确定诊断。

2.对肿瘤的良、恶性进行综合判断。

3.发现微小转移灶。

4.激素受体的检测，以指导临床治疗。

5.激素类细胞的定性和定位。

6.指导肿瘤分期。

7.指导肿瘤预后的判断。

8.免疫性疾病的辅助诊断。

（一）免疫荧光组织化学技术

用免疫荧光技术显示和检查组织或细胞内的抗原或半抗原的方法称之为免疫荧光组织化学技术。是现代生物学及医学中广泛应用的技术之一。由于其在特异性、快速性和在细胞水平定位的敏感性与准确性，已在免疫学、病理学、肿瘤学等相关学科得到广泛应用。

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制备成荧光抗体（抗原），使其作为探针检查与细胞或组织内的相应抗原物质发生反应，形成抗原抗体复合物，在细胞和组织中的这种抗原抗体复合物含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而对抗原或抗体做出定量、定性的判断。

免疫荧光组织化学技术染色方法分为直接法、间接法、补体法。

1.直接法　直接法是最简便、快速的方法，是指用已知特异性抗体或抗原与荧光素结合，制成特异性荧光抗体或抗原，直接与细胞或组织内的抗原或抗体结合反应，形成抗原抗体复合物，并在荧光显微镜下呈现特异性显色。此方法特异性强，常用于肾穿刺及病原体的检查。缺点是敏感性较差。

染色步骤：①组织固定后，石蜡切片常规脱蜡至水；②用0.05%胰蛋白酶消化20min；③PBS液洗涤后吹干；④滴加荧光抗体，置于37 ℃，30～60min或4 ℃过夜；⑤PBS液洗2次，5min/次；⑥50%缓冲甘油封固；⑦荧光显微镜观察。

注：

PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）：氯化钠8.0g，磷酸氢二钠0.5g，磷酸二氢钠0.2g，加蒸馏水至1 000mL，溶解后，用pH值计或精密试纸测定pH值。

50%甘油缓冲液：甘油20mL，加碳酸盐缓冲液20mL，充分混合，待气泡消失后即可使用。

对照试验：

（1）标本自发荧光对照　标本切片只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，应呈阳性荧光。

（2）阳性对照　将已知阳性标本用直接法染色，结果应为阳性。

2.间接法

（1）检查抗原方法　用已知抗体检测未知的抗原时，先用特异性抗体与相应抗原结合，再用荧光色标记的抗抗体（抗已知抗体的抗体）与特异性抗体结合，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现特异性荧光显色。此法常用于检验血清中自身抗体和多种病原体的检查。

（2）检查抗体方法　用已知的抗原检测未知的抗体时，先用特异性抗原与细胞或组织内抗体结合，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，形成抗体-抗原-荧光抗体复合物，由于结合在抗原抗体复合物上的抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。现在应用较为广泛。

染色步骤：①组织固定后，石蜡切片常规脱蜡至水；②用0.05%胰蛋白酶消化20min；③PBS液洗涤后吹干；④滴加一抗与切片上，放入湿盒，37 ℃，45min；⑤PBS液充分洗涤，并擦去组织周围液体；⑥在切片上滴加荧光素标记的二抗，放入湿盒，37 ℃，30min；⑦50%缓冲甘油封固；⑧荧光显微镜观察。

对照试验：

（1）标本自发荧光对照　标本切片只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，应呈阳性荧光。

（2）阳性对照　将已知阳性标本用直接法染色，结果应为阳性。

（3）荧光抗体对照　标本只加间接荧光抗体染色，结果应为阴性。

3.补体法

（1）直接检查组织内免疫复合物法　用抗补体C3等荧光抗体直接作用于组织切片，使其与结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现荧光的部位就是免疫复合物上补体的存在处，常用于肾穿刺组织活检。

（2）间接检查组织内抗原法　将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37 ℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗体补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原抗体-补体-荧光抗体的复合物，此方法的优点是只需用一种荧光抗体，可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。

（3）双重免疫荧光细胞化学标记法　在同一细胞组织标本上同时检查两种抗原时，可进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的抗体，两种抗体分别用不同的荧光素标记，并显示不同的颜色，故可明确显示两种抗原的位置。

染色步骤：①涂片或冰冻切片固定；②PBS液洗涤后吹干；③吸取经适当稀释的一抗及补体的等量混合液，滴于切片上，放入湿盒，37 ℃，30min；④PBS液充分洗涤2次，5min/次，可振动或搅拌，并擦去组织标本周围液体；⑤滴加经适当稀释的抗补体荧光抗体，放入湿盒，37 ℃，30min；⑥PBS液冲洗2次，5min/次，蒸馏水洗1min；⑦50%缓冲甘油封固；⑧荧光显微镜观察。

对照试验:

（1）标本自发荧光对照　标本切片只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察，应呈阳性荧光。

（2）阳性对照　将已知阳性标本用直接法染色，结果应为阳性。

（3）补体对照　取新鲜豚鼠血清1∶10稀释后作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果应为阴性。

（4）抑制试验　标本加灭活的第一抗体，再加1∶10稀释的新鲜豚鼠血清孵育，再加未标记的抗体血清与补体荧光抗体等量的混合液，结果应为阴性。

（二）免疫酶组织化学技术

免疫酶组织化学技术是通过抗原抗体特异性反应，借助酶组织细胞化学的手段，检测抗原或抗体在组织细胞内部存在的一门技术，是在免疫荧光法的基础上发展起来的。基本原理是预先将抗体与酶结合，形成酶标抗体，再利用酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶产物或形成有一定电子密度的颗粒，然后借助光镜或电镜进行观察，对待检抗原或抗体进行定位分析。本方法有敏感性高、染色标本保存时间长等优点，已成为免疫组化最常用的方法之一。

免疫酶组织化学技术按照酶是否预先与抗体通过共价键链接在一起可分为酶标抗体法和非标记抗体酶法，前者包括直接法和间接法，后者包括酶桥法、PAP法等染色方法。

1.直接法　是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，直接与细胞内特定抗原结合，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物或有一定电子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内抗原成分的定位、定量、定性分析。此方法操作简便、特异性强、非特异性背景反应低等优点，常用于肾组织穿刺活检等检查。

染色步骤：①组织固定后，石蜡切片常规脱蜡至水；②用3%双氧水或0.3%双氧水甲醇液处理切片5min，以封闭内源性酶的活性；③PBS液洗涤后吹干；④抗原修复；⑤用经稀释的动物正常血清孵育切片20～30min，以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色；⑥甩去动物血清，加稀释的酶标抗体，置于湿盒中37 ℃反应20～60min或4 ℃过夜；⑦PBS液充分冲洗；⑧0.04%～0.05%DAB-双氧水液显色5～10min；⑨缓冲液冲洗，流水洗涤；⑩苏木精染色细胞核；脱水、透明、封固，观察切片。

注：DAB（3，3-二氨基联苯胺）：配方（0.05 mol/L pH值7.6），再加入0.1mL浓度为3%的双氧水，6mL DAB溶于10mL 0.05 mol/L TBS过滤掉沉淀物，即可。

2.间接法　是先用特异性抗体（一抗）与组织中的抗原结合，再用与酶结合的特异性抗体（二抗）与一抗反应，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后通过酶的底物显色。间接法比直接法更实用，在酶标抗体染色中最为常用。

染色步骤：

①组织固定后，石蜡切片常规脱蜡至水；②用3%双氧水或0.3%双氧水甲醇液处理切片5min，以封闭内源性酶的活性；③PBS液洗涤后吹干；④抗原修复；⑤用经稀释的动物正常血清孵育切片20～30min，以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色；⑥加稀释的特异性抗体，置于湿盒中37 ℃反应20～60min或4 ℃过夜；⑦PBS液充分冲洗，加酶标抗体，置于湿盒中37 ℃孵育30min；⑧PBS液充分冲洗；⑨0.04%～0.05%DAB-双氧水液显色5～10min；⑩缓冲液冲洗，流水洗涤；苏木精染色细胞核；脱水、透明、封固，观察切片。

3.酶桥法　用化学交联法将酶与抗体分子连接，染色时在特异性抗体与标本中抗原结合之后用桥抗体结合于其上，再将抗酶抗体结合于桥抗体上，最后把酶结合在酶抗体上，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。此方法提高了敏感性，非特异染色较轻。抗酶抗体必须是高效价、经过高度纯化，否则将降低敏感性。

染色步骤:①组织切片脱蜡至水；②PBS液冲洗2次，5min/次；③用0.3%双氧水-甲醇在室温中处理切片5～30min；④充分水洗后，PBS液冲洗2次，5min/次；⑤用经稀释正常血清，室温处理切片30min；⑥PBS液冲洗2次，5min/次；⑦滴加一抗后，置入4 ℃恒温箱，处理16～24 h；⑧PBS液冲洗2次，5min/次；⑨滴加二抗后，室温处理30min，PBS液冲洗2次，5min/次；⑩滴加抗酶抗体，室温下30min，PBS液冲洗2次，5min/次；用过氧化物酶溶液作用30min，PBS液充分洗净；在DAB-双氧水液中进行显色5～30min，镜下控制。苏木精衬染、脱水、透明、中性树脂封固。

4.PAP法　PAP法的基本原理与酶桥法相同，只是用酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，把两个步骤合并为一个步骤。敏感性比间接法提高近20倍。但存在比较重的非特异性背景染色。

染色步骤：①组织切片脱蜡至水；②用0.3%双氧水-甲醇在室温中处理切片5～30min；③充分水洗后，PBS液冲洗2次，5min/次；④经稀释正常血清，室温下处理30min；⑤滴加一抗（兔），置入4 ℃恒温箱中反应13～24 h；⑥PBS液冲洗2次，5min/次；⑦加羊抗兔IgG，室温下处理30min，PBS液冲洗2次，5min/次；⑧加PAP，室温30min，PBS液冲洗2次，5min/次；⑨用DAB显色5～30min；⑩苏木精衬染、脱水、透明、中性树胶封固。

（三）亲和免疫组织化学技术

亲和免疫组织化学技术是指利用两种物质之间的高度亲和性，将酶、荧光素等标记物与亲和物质连接，对抗原或其他靶物质进行定位定量检查的方法。目前已发现的高度亲和能力物质有抗生物素-生物素、植物凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白与IgG、激素与受体等。此方法具有敏感性强、特异性强、方法简便，并可用双重、多重染色等优点。

下面简要介绍几种常用的染色方法。

1.ABC法　本方法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学特性，先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一个复合物。特异性抗体与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物。生物素化二抗再与特异性抗体反应，然后加入ABC复合物，形成抗原-特异性抗体-生物素化二抗-卵白素-生物素-HRP复合物。最后DAB显色。

染色步骤：

①常规石蜡切片，脱蜡至水；②PBS液冲洗2次，5min/次；③0.3%甲醇-双氧水，37 ℃环境下处理30min；④PBS液冲洗2次，5min/次；⑤正常动物血清20min，37 ℃；⑥滴加经稀释的特异性抗体，37 ℃处理60min；⑦PBS液冲洗2次，5min/次；⑧滴加适当稀释的生物素标记二抗，37 ℃处理30min；⑨PBS液冲洗2次，5min/次；⑩加入ABC复合物处理30～60min，37 ℃；PBS液冲洗2次，5min/次；DAB显色，镜下控制；苏木精衬染、脱水、透明、中性树胶封固。

附：微波-ABC法

染色步骤：①常规脱蜡，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min，无水乙醇Ⅰ、 Ⅱ各10min；②将切片置入装有PBS液的染色缸中，微波修复1min，冷却置室温；③滴加第一抗体，微波修复1min，孵育20min，PBS液冲洗3缸各3min；④滴加第二抗体，微波修复1min，孵育10min，PBS液冲洗3缸各3min；⑤滴加第三抗体，微波修复1min，孵育10min，PBS液冲洗3缸各3min；⑥DAB显色，显微镜下控制；⑦终止显色，蒸馏水水冲洗；⑧苏木精衬染，盐酸乙醇分化，水洗，封片。

注意事项：内源性生物素活性剂的消除：生物素是一种辅酶，存在于某些组织细胞内，在应用ABC法染色时会出现与抗生物素结合而产生非特异性染色。因此，对抗生物素结合性较高的组织如肝、肾、白细胞、红细胞、脂肪组织等在应用ABC法前应预先消除内源性抗生物素结合活性。

生物素制剂之间互相亲和性差异较大，因此，在应用ABC试剂时，应注意厂家和批号。对新购进的试剂事先预测，以保证实验结果的稳定性。

注意ABC试剂的保存温度，以4 ℃为佳，在-20 ℃生物活性在短期内即可破坏。

2.SP法　链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素SA卵白素连接的部位，且二者间有极强的亲和力，链霉素的等电位接近于6.5。因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。SP采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

染色步骤：①石蜡切片脱蜡至水；②3%双氧水室温孵育5～10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；③蒸馏水冲洗，PBS液浸泡5min（如需采用抗原修复，可在此步后进行）；④5%～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃过夜；⑤PBS液冲洗3次，5min/次；⑥滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37 ℃孵育10～30min或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37 ℃或室温孵育10～30min；⑦PBS液冲洗3次，5min/次；⑧滴加适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37 ℃孵育10～30min；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃或室温孵育10～30min；⑨PBS液冲洗3次，5min/次；⑩DAB或AEC显色剂显色；自来水充分冲洗，复染，封片。

附：冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片4～8 μm，室温放置30min后，加入4 ℃丙酮固定10min，PBS洗，5min各3次。用3%过氧化氢孵育5～10min，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5min各2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。

病理诊断常用的染色是HE染色，而免疫组化技术仅仅是一种辅助手段。在免疫组化检测项目的选择方面，病理医师一要结合临床医师的要求，二要满足诊断与鉴别诊断的需要，采取积极、慎重、合理和节约的原则，选择免疫组化项目。不能盲目滥用，以免造成不必要的混乱和加重病人的经济负担。

（一）免疫组化染色的工作程序

1.初诊医师根据常规HE切片诊断中遇到的问题，提出免疫组化试验，交上级医师核准。

2.针对诊断难点及免疫组化标记的抗体种类，填写免疫组化工作单，交免疫组化技术室。

3.免疫组化室染好切片后，经质控医师检查合格（即染色程序无误、对照染色可靠）交给初诊医师。

4.初诊医师根据免疫组化染色结果，提出初步的诊断，交上级医师复查。

5.上级医师复查后，发出最后报告，并附上免疫组化结果。

6.根据临床医师提出的免疫组化申请，完成各项检查。

7.报告发出后，将切片送回免疫组化室归档。

(二)免疫组化染色常见问题及处理

当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种原因。

1.对照标本和目标标本均无着色

（1）确认是否漏加了某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。

（2）确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。

（3）对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）。

（4）检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。

（5）检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4～8 ℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。

（6）检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。

（7）检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。

（8）检查复染剂和封片剂是否和所用的色原匹配。

2.弱阳性　如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外还应考虑:

（1）标本的固定方式不当或固定时温度过高，都会影响所检测的抗原数量和质量。

（2）不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。

（3）抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度时间是否正确。一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的浓度使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。

（4）切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

（5）孵育时切片是否水平放置，否则会导致抗体流失。如果阴性对照没有反应，阳性对照反应良好，而标本弱阳性，则可能是由于阳性对照不是同一种组织或固定方式不同等原因所致。

（6）除抗体浓度过低，孵育时间过短，试剂超过有效使用期，缓冲液未吸干，造成试剂被稀释，防止切片干燥外，还有复染或衬染太深，室温太低（低于15 ℃），组织经固定和包埋等处理后抗原丢失严重；虽然环境温度为4～20 ℃，但过度血清蛋白封闭等原因也可影响结果。

（7）操作步骤错误，组织中无抗原，一抗与二抗种属连接错误和试剂失效等原因。

3.非特异性染色

（1）是否有效地去除了内源性酶和内源性生物素。应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或内源性生物素丰富的组织，如肝、肾等，须考虑此原因。处理的方法如下。

灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持pH值在7.6～8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50 mmol/L 的酒石酸抑制。

饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。具体方法是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25g/mL亲和素溶液中处理15min，PBS清洗15min后即可染色。

（2）是否选择使用了正确的封闭血清。电荷吸附所造成的非特异性背景染色消除方法是以二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%～10%溶液孵育切片，以封闭吸附位点。有时其他无关蛋白，如牛血清白蛋白也常应用。另外，取材时避开出血、坏死区亦极重要。最近有些国内的实验室应用5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭，效果也不错。

（3）所选择的抗体是否符合实验要求。因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。

（4）一抗的使用浓度是否过高。

（5）清洗是否充分。应严格操作规程。因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05 mol Tris-HCl,0.15 mol NaCl已适用于多数染色方法，溶液内加入吐温-20 效果更佳。特殊标记时，试剂公司一般都提供缓冲液的配方。

（6）DAB的使用是否正确。DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性；粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须滤除去，否则可能沉积于切片组织上产生斑点状着色。另外，DAB保存不妥产生氧化物亦可沉淀于切片上，因此，须将DAB保存置于闭光干燥处，现用现配，临用前加H2O2孵育时间过长也会造成背景染色。

（7）标本染色过程中是否曾经干涸，否则会造成边缘部的非特异性染色。

（8）检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。

（9）操作过程中冲洗不充分，组织切片折叠，组织中含过氧化物酶未阻断，组织抗原弥散，切片黏附剂过厚，血清蛋白封闭不充分，在室温1 h中超过37 ℃降至室温20～28 ℃或4 ℃过夜孵育温度过高等原因。

1.PBS磷酸盐缓冲液（pH值7.4）

氯化钠　　　　　　　8g

氯化钾　　　　　　　0.2g

磷酸氢二钠　　　　　1.44g

磷酸二氢钾　　　　　0.24g

将上述各种试剂溶于800mL水中，用HCl（1 mol/L）或NaOH（1 mol/L）将pH值调至7.4，加水至1 000mL即可。

2.TBS

Tris缓冲液（0.5 mol/L pH值7.6）　　　　　　储备液

Tris（三羟甲基氨基甲烷）　　　　　　　　　　12.1g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17.5g

浓盐酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　约7mL

双蒸水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加至2 000mL

先以少量双蒸水（300～500mL）溶解Tris，加入7mL浓盐酸后，用HCl或NaOH将pH值调至7.6，最后加双蒸水至2 000mL。此液为储备液，4 ℃冰箱中保存。

Tris缓冲液 (0.5 mol/L pH值7.6)　　　　　　工作液

Tris-HCl缓冲液（0.5 mol/L pH值7.6）　　　 100mL

NaC　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 l8.5～9g（0.15 mol/L）

双蒸水加至　　　　　　　　　　　　　　　　1 000mL

TBS配制方法:

先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入Tris-HCl缓冲液，最后加双蒸水至1 000mL，充分摇匀。

3.枸橼酸盐缓冲液

储存液：

0.1 mol/L枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸（C6H8O7·H2O）溶于1 000mL 蒸馏水中。

0.1 mol/L枸橼酸钠溶液:称取29.41g枸橼酸钠（Na3C6H5·2H2O）溶于1 000mL蒸馏水中。

工作液:

取9mL A液和41mL B液加入450mL蒸馏水中，溶液pH值应为6.0±0.1。

4.胰酶

胰蛋白酶消化液:

取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100mL 0.05%或0.1% pH值7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。

5.0.4％胃蛋白酶

胃蛋白酶400 mg溶于100mL的0.1 mol/L HCl中即可。

6.DAB（3，3-二氨基联苯胺）

6 mg DAB溶于10mL 0.05 mol/L TBS（0.05 mol/L pH值7.6），再加入0.1mL浓度为3%的H2O2，过滤，即可。

7.AEC

4 mg AEC溶于1mL二甲基甲酰胺中，加入14mL浓度为0.1 mol/L的醋酸缓冲液（pH值5.2），然后加入0.15mL 3%H2O2，过滤。

8.Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）

免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储存液，临用时稀释至所需浓度。

30%TritonX-100的配制:

Triton X-100　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　28.2mL

0.1 mol/L PBS（pH值7.3）或0.05M TBS（pH值7.4）　　　　72.8mL

蒸馏水　　　　　　　加至　　　　　　　　　　　　　　　1 000mL

9.甲醇-H2O2溶液

吸取30%的H2O2 1mL，加入100mL纯甲醇中充分混匀即可，使H2O2终浓度为0.3%。

（一）一般性标记物

1.CK（角蛋白）

CK亚型：①CK5/6；②CK7；③CK8；④CK10/13；⑤CK18；⑥CK19；⑦CK20。

2.EMA（上皮细胞抗原）

（二）特异性和（或）相对特异性上皮标记物

1.CEA（癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌）

2.CA242（肿癌相关黏液抗原，标记胰腺癌、大肠癌）

3.TG（甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌）

4.PSA（前列腺特异性抗原，标记前列腺癌）

5.PSAP（前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌）

6.34βE12（标记前列腺底细胞）

7.AFP（甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌）

8.Hepatocyte（标记肝细胞癌）

9.β-HCG（β-绒毛促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤）

10.CA125（卵巢癌）

主要是Vimentin（Vim，波性蛋白）等。

（一）Desmin（Des,结合蛋白）

（二）Actin（肌动蛋白）

（三）SMA（平滑肌肌动蛋白）

（四）MSA（肌特异性肌动蛋白）

（五）Myosin（肌球蛋白）

（六）Myoglobin（MG,肌红蛋白）

（七）Myogen（肌浆蛋白）

（八）MyoD1（肌调节蛋白）

（一）FⅧRAG（第8因子相关抗原）

（二）CD31

（三）CD34

（四）UEA-1

（五）BNH9

（一）CD68/KP-1

（二）Lysozyme（溶菌酶）

（三）α1-AT（α1-抗胰蛋白酶）

（四）α1-ACT（α1-抗胰糜蛋白酶）

（五）Mac387

（一）全淋巴细胞

1.CD45/LCA（白细胞共同抗原）

2.TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）

3.CD30/Ki-1

（二）全B细胞

1.Igκ

2.Igλ

3.CD20/L26

4.CD79a

5.BLA36（B淋巴细胞抗原）

（三）B细胞亚型

1.CD10

2.CD21（标记滤泡性树突状细胞）

3.CD23

4.CD35（标记滤泡性树突状细胞）

5.CD38

（四）全T细胞

1.CD3

2.CD5

3.CD43

4.CD45RO/UCHL-1

（五）T细胞亚型

1.CD1a

2.CD4

3.CD8

（六）NK细胞

1.CD56

2.CD57/Leu-7

3.CD16/Leu-11

（七）粒细胞和单核细胞巨噬细胞

1.CD11c/LeuM5

2.CD15/LeuM5

3.Lyssozyme（溶菌酶）

4.α1-AT（α1-抗胰蛋白酶）

5.α1—ACT（α1-抗胰糜蛋白酶）

6.CD68

7.S-100蛋白

8.Mac387

（八）其他

1.EMA（上皮细胞膜抗原）

2.CD99（尤因肉瘤标记物）

3.ALK-1（间变性淋巴瘤激酶）

4.HLA-DR

5.Bcl-2

6.Bcl-6

7.Bcl-10

8.Ki-67

9.Cyclin D1（周期素D1）

10.CD25

11.CD34

（一）S-100蛋白

（二）NSE（神经元特异性烯醇化酶）

（三）Leu7

（四）Neurofilament（NF，神经微丝蛋白）

（五）GFAP（胶质纤维酸性蛋白）

（一）激素标记物

1.CA（儿茶酚胺）

2.5-HT（5-羟色胺）

3.垂体激素

（1）GH（促生长素）

（2）PRL（促乳素）

（3）ACTH（促肾上腺皮质激素）

（4）TSH（促甲状腺素）

（5）FSH（促滤泡素）

（6）LH（促黄体素）

4.甲状腺

（1）TG（甲状腺球蛋白）

（2）CT（降钙素）

5.甲状旁腺：PTH（甲状旁腺素）

6.胰岛

（1）Insulin（胰岛素）

（2）Glucagon（胰高糖素）

（3）VIP（舒血管肠肽）

（4）PP（胰多肽）

（5）Somatostatin（生长抑素）

（6）Gastrin（胃泌素）

（二）非激素标记物

1.NSE（神经元特异性烯醇化酶）

2.CgA（嗜铬素A）

3.SY（突触素）

（三）激素受体

1.ER（雌激素受体）

2.AR（雄激素受体）

3.PR（孕激素受体）

（一）PCNA（增殖细胞核抗体）

（二）Ki-67

（一）S-100蛋白

（二）HMB45

（三）Melanoma

（一）bcl-2

（二）c-erbB-2

（三）P53

（四）P16（多肿瘤抑制基因）

（五）nm23

（一）Myocobacterium Bovis（分枝杆菌，抗卡介苗）

（二）HBsAg（乙型肝炎病毒表面抗原）

（三）HBcAg（乙型肝炎病毒核心抗原）

（四）HPV（人乳头状瘤病毒）

（五）HTLV-1（人类T细胞白血病病毒）

思考题

1．免疫组化染色的基本原理是什么？

2．常用的免疫组化染色方法有哪些？