细菌的染色涂片固定的意义

学习目标

◆掌握诊断细胞学的概念、分类。

◆能完成脱落细胞学和针吸细胞学标本的采集、制片、固定、染色、诊断。

◆掌握细胞学诊断的规范报告格式。

任务描述

细胞学检验技术是病理学检验技术的一大分支，通过学习病理细胞学检验的基础知识、基本技能，掌握病理细胞学诊断的方法，能规范完成细胞学检验的固定、染色、制片，准确辨认正常上皮细胞和炎性、恶性肿瘤细胞，并能够向临床或病人合理解释细胞学报告。

诊断细胞学是以观察细胞的结构和形态变化来研究和诊断临床疾病的一门学科，又称临床细胞学，它是病理学的一个重要组成部分。

诊断细胞学根据标本来源的不同，分为脱落细胞学和针吸细胞学。

1．脱落细胞学　是利用生理或病理情况下，自然脱落下来的细胞标本作为研究对象，如：痰、胸腹水、尿液、脑脊液、支气管刷片、宫颈刮片等的检查。

2.针吸细胞学　是利用细针穿刺病灶，吸取病变部位的少许细胞，作为研究对象，如：淋巴结、乳腺、甲状腺肿物及体表肿物穿刺等标本的检查。这种方法有独特的优点，目前已成为医学上一个重要的诊断手段。

1．用于诊断肿瘤，防癌普查。

2．癌症治疗后的随诊观察。

3．观察卵巢功能，指导内分泌治疗。如：通过宫颈刮片检查，即可推断病人的激素水平。

4．诊断某些良性病变，如：宫颈刮片发现滴虫，诊断滴虫性阴道炎；发现线索细胞，诊断为细菌性阴道炎；淋巴结穿刺诊断组织细胞坏死性淋巴结炎等。

5．有时可以起到一定的治疗作用，比如：通过抽吸脓液治疗化脓性乳腺炎、软组织化脓性炎症等。

（一）优点

1．方法简便易行，容易掌握。

2．对设备要求不高，费用低，易推广。

3．病人痛苦少或无痛苦，乐于接受。

4．取材方便，可反复取材，不影响治疗。

5．诊断迅速，检出率高，深受临床医生欢迎。

（二）缺点

由于诊断细胞学主要是观察细胞形态（平面）变化而看不到组织结构（立体）的改变，因此，存在一定的局限性。

1．检查属抽样性取材，因此，取材不准或制片过厚、过薄均可影响诊断。

2．脱落细胞常有退变（图4-1），易受人为因素（挤压）的影响。

图4-1　退变细胞（HE染色 10×10倍）

3．涂片中看不到组织结构的改变，故诊断准确性受一定影响，病变分型较困难。

4．非肿瘤疾病研究较少。

5．易出现假阴性或假阳性。

假阴性：是指取材没取到瘤细胞，或镜检时瘤细胞漏检，或将瘤细胞当作炎性改变的细胞等，致使肿瘤病人本应查到瘤细胞而没有查到，报告了阴性，称为假阴性。假阴性率一般为10%左右。

假阳性：是指把非肿瘤细胞，如炎症改变或退变的细胞等当作肿瘤细胞，报告查见瘤细胞，因此称为假阳性。假阳性率通常≤1%。

1．尽量减少病人的痛苦，取得其合作。

2．尽可能使方法简便、快速，并能获得丰富的细胞成分。

3．及时制作，尽量保持标本新鲜，避免污染。

（一）目的

是将采集的细胞成分均匀置于载玻片上，以便镜下检查。

（二）涂片要求

1．细胞涂布均匀，分布在载玻片一端2/3范围内，其余1/3留作贴标签。

2．涂片时勿用力挤压或摩擦，防止细胞由于挤压损伤或变形。

3．做好标记，刻写编码，防止张冠李戴。

（三）制片方法

1．涂抹法　为细胞学标本最常用的方法，常用棉签棒、针头或吸管将标本均匀涂抹于载玻片上，应注意：涂片动作应轻柔利索，沿一个方向，一次涂抹而成，不能来回转圈和往返涂抹。

2．拉片法　常选小滴状标本，置于两张载玻片之间，稍加压力反向拉开，即成两张厚薄均匀的涂片。拉片法制片可适用于痰、胸腹水和穿刺细胞标本。

3．推片法　同《临床检验基础》血涂片制备，即选一个边缘光滑的载玻片做推片，并使推片与载玻片之间呈40°左右的夹角，将载玻片上的细胞标本匀速推动，做成细胞涂片。常用于穿刺细胞和体液标本。应注意：因癌细胞体积较大，常位于细胞涂膜的尾部，因此，推片时不要将尾部推出片外。

4．印片法　取新鲜组织标本，切开后，用载玻片轻压切面，即可将细胞黏附于玻片上，称印片法。

脱落细胞是指正常或病理情况下，自然脱落下来的细胞，随分泌物、排泄物排出体外。恶性肿瘤的组织细胞之间黏合力下降，加上常有出血坏死等情况，致使肿瘤细胞更易脱落。这是脱落细胞学用以临床诊断的理论依据。如痰液、尿液细胞学检查，可分别查到呼吸道、泌尿道肿瘤细胞，子宫颈刮片可查见宫颈恶性瘤细胞。

脱落细胞学检查流程包括：标本采集、涂片、固定、染色、封片、阅片等过程，其中细胞学制片是诊断细胞学的基础。

（一）痰液脱落细胞检查

痰细胞学检查是肺癌诊断的重要依据之一，并对其他肺部疾病提供诊断依据。如:肺结核、肺寄生虫、肺真菌病都有可能在痰标本染色镜检查中有所发现。

1.标本采集

（1）自然咳痰法。嘱病人早晨咳痰之前，应漱口、刷牙，以免食物残渣和细菌的污染。指导病人深呼吸后用力深咳，咳出肺深部的痰液，以2～3mL为宜，吐入痰盒内送检。

（2）吸痰法。

（3）直接刷片法，支气管镜刷片。

2.痰的性状及制片

（1）黏液痰：痰中有乳白色颗粒状物，往往提示有肺癌的可能。取这部分的痰液作为涂片检查。

（2）黏液脓性痰：仔细挑选黏液丝的部分做诊断细胞学制片。

（3）脓性痰：为黄色或黄绿色的黏痰，因细菌的种类不同，痰的黏稠度和颜色可有不同，常见于气管、支气管和肺化脓性感染。这种痰最好经抗感染治疗后再送检，以取得较好的结果。

（4）泡沫痰：痰呈泡沫状，应取其中的黏液丝做涂片检查。

（5）血丝痰：常见于肺癌、肺结核，有时也见于支气管炎。应取带血丝的痰全部制片。

3.注意事项

（1）咳痰时一定要用力深咳，痰量一般以2～3mL为宜，采痰容器内面应涂蜡。

（2）吐痰后，应立即送检、即刻固定，防止细胞退变；一般情况痰标室温可保存2～4 h，冰箱内可保存2 d。

（3）带血丝的痰可以随时送检。

（4）最好左支气管镜检查5～10 d后再行痰细胞检查。

（5）报告如果为阴性，应连续送检3次，每天1次。

（二）胸腹水脱落细胞检查标本的采集与制片

胸腹水脱落细胞学检查简便易行、准确可靠，可作为恶性肿瘤早期筛查手段。

1.胸腹水脱落细胞采集　送检胸腹水标本（图4-2）100mL以上，取出20mL分置两个试管中，用离心机以3 000 r/min，15min。将沉淀物吸至玻片上，用吸管与玻片平行方向轻轻擦涂，使沉淀物在玻片上均匀分布、厚度适宜、晾之稍干固定、染色。但传统的离心法由于细胞少，涂片厚，阳性率不高，现已不使用。现多应用膜式液基薄层细胞学技术(thinprep cytology test,TCT)（图4-3），将炎症细胞、红细胞等体积较小的细胞过滤出去，将异型增生细胞、癌细胞、恶性瘤细胞等体积较大的细胞保留，并将所有液体全部过滤。达到了瘤细胞多，血细胞少，涂片薄、均匀的最佳效果。

图4-2　胸水标本

图4-3　细胞采集器

　　

2. 膜式液基薄层细胞学技术操作方法

（1）打开电源开关。

（2）将细胞采集器（图4-4）的圆锥接头与抽液设备紧密连接，另一端放入胸腹水标本中。

（3）按抽液设备开关键，对标本进行抽吸，使标本液单向流动，并完成对标本液中脱落细胞的浓缩截留过程。

（4）轻轻地、顺时针打开细胞采集器的浓缩器，用镊子把膜片取出（图4-5），将膜片上无截留物面向上置于载玻片上。

（5）拖动膜片与载玻片上几次，使膜片上的截留浓缩物与膜片分离，而留于载玻片上。

（6）制片，固定。

3.注意事项　如果报告为阴性，应连续送检3次。

图4-4　细胞采集器的圆锥接头与抽液
设备紧密连接

图4-5　取膜制片

　　

（三）女性生殖道脱落细胞的采集与制片

女性生殖道脱落细胞在生殖道炎症、恶性肿瘤诊断、宫颈癌筛查等方面有重要价值。

1.女性生殖道脱落细胞的采集　宫颈外口刮片是诊断宫颈癌的重要标本来源。传统方法是先用棉棒拭净宫颈口的分泌物，后用小脚板在宫颈外口（鳞、柱状上皮交界处）轻轻刮一圈，涂片固定。涂片缺点为：涂片面积较大，不集中，厚薄不均，炎症细胞及黏液较多。为克服以上缺点，现多采用膜式液基薄层细胞学技术（图4-6），此种技术的优点是：涂片面积小，细胞量多，分布均匀，炎症细胞、黏液较少，方便阅片，阳性诊断率高。

图4-6　液基细胞学沉降式自动染色制片机

2.雌激素分泌水平检查标本的采集　取材最佳部位为:阴道侧壁的上1/3处，其次是阴道后穹隆，未婚女性可在小阴唇内侧取材。

3.液基细胞学制片操作

（1）打开电源开关。

（2）收到标本后，先充分摇匀，过滤。

（3）将标本离心，震荡。

（4）将震荡后的标本放入机器中，并按开始键，机器进入自动制片过程。

（5）制片成功后，机器发出“滴滴”响声后，制片完成。

（6）每天所有制片完成后，将机器擦拭干净，关闭电源。

4.注意事项

（1）细胞涂片前24 h内不能同房、盆浴、阴道冲洗和用药。

（2）宫颈管刮片之前，必须严格消毒，防止感染。

（3）阴道细胞取材时勿碰及子宫颈，近期无论局部或全身均不能应用对阴道上皮有影响的药物。

（四）尿液脱落细胞标本的采集与制片

尿液脱落细胞检查是泌尿系结核、肿瘤等疾病诊断的重要手段。

1.尿液脱落细胞采集方法　新鲜尿标本，随留随送检，至少50mL以上。

2.操作方法　同胸腹水操作法。

3.注意事项

（1）最好不送晨尿。因为晨尿细胞容易退变，影响诊断。

（2）如果报告为阴性，应连续送检3次。

（五）食管、胃、支气管脱落细胞标本的采集与制片

1.随着电子胃镜、气管镜的普及，食管、胃、支气管刷片成为咬检组织的有利补充，在某些特殊情况下，病人不方便咬检，就可以做一下刷片判断病变的良恶性。

2.注意事项：刷片后即刻涂片、固定，防止细胞退变。

目的：防止细胞内的酶将蛋白质分解而自溶、沉淀或凝固细胞内物质，保持细胞形态结构与组织生活时相仿，使细胞各部分易于着色。一般涂片涂好后应立即固定。但如果液体很稀薄，含蛋白质很少的尿液、胸腹水等涂片后干燥固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量。

（一）固定方法

1.带湿固定　即涂片尚未干燥即行固定。适用于痰液、宫颈刮片及食管刷片等较黏稠的标本。

2.干燥固定　即涂片自然干燥后，再行固定。适用于较稀薄的标本，如尿液、浆膜腔积液等。

3.固定时间　一般为15～30min，含黏液较多的标本如痰液、宫颈刷片等，固定的时间要适当延长；不含黏液的标本，如尿液、胸腹水等，固定时间可酌情缩短。

（二）常用固定液

1.95%乙醇　是最常用的细胞固定液，可加入1%的冰醋酸（按95%乙醇99份，冰醋酸1份的比例），以增强固定效果，并能对抗乙醇固定的收缩作用。

2.乙醚乙醇固定液　由95%乙醇49.5mL，乙醚49.5mL，冰醋酸1mL，固定效果较好。但乙醚易燃，易挥发，价格贵，临床使用较少。

3.Carnoy液　无水乙醇：氯仿：冰醋酸=6∶3∶1。此固定液穿透力强，固定效果好。但价格贵，配制麻烦，一般只在核酸、糖原和黏蛋白等特殊染色中应用。

4.甲醇　固定效果好，核结构清晰，常用于瑞氏、MGG染色或免疫组化染色的自然干燥涂片预固定。一般滴加数滴铺满涂膜即可。

5.丙酮　穿透力强，对酶类固定效果好，常用于酶的组织化学染色固定。

（三）注意事项

1.根据染色要求和固定液特点，选择合适的固定液。如巴氏或HE染色，选95%乙醇；MGG染色选甲醛固定液；瑞士染色以空气干燥固定为宜。

2.防止交叉污染，保持固定液浓度。一般乙醇固定液浓度低于90%，不再用作固定液。

3.液体标本在涂片后，让其在空气当中放置片刻，待涂膜周边稍干而中央尚未干时浸入固定液即潮干固定，如等全部细胞干燥后再固定，染色后细胞肿胀、核染色质结构模糊不清，此为人为退变，常严重影响诊断。

4.标本固定时间不宜短于15min，最好在48 h内染色。穿透力强的固定液勿过夜染色。如果固定时间已到，应力争及时染色。

目的：使细胞结构清晰，透明度高，便于观察。染色方法归纳起来有两大类，即常规染色方法和特殊细胞化学染色方法。常用的染色方法有以下几种：

（一）苏木精伊红染色法（同组织切片染色）

染色结果，细胞核染成蓝色，细胞浆染成红色或粉红色（图4-7～图4-9）。

图4-7　宫颈鳞状上皮细胞（HE染色10×10倍）

图4-8　纤毛柱状上皮细胞与杯状细胞（HE染色20×10倍）

图4-9　纤毛柱状上皮细胞与杯状细胞（HE染色20×10倍）

（二）巴氏染色法

巴氏染色细胞透明度好，结构清晰，涂片色彩丰富而鲜艳，由于能显示鳞状上皮不同角化程度，常用于阴道涂片测定雌激素水平。宫颈涂片和痰涂片中分化差的鳞癌小角化细胞显示橘黄色，在红色坏死背景中特别突出，不易漏诊。

1．染液配制

（1）Harris苏木精（同组织染色）。

（2）橙黄-G6：取橙黄-G6 0.5g，溶于95％乙醇100mL中，加磷钨酸15 mg。

（3）EA36染液

先配制原液（贮备液）：

1）亮绿液：亮绿0.5g，溶于5mL蒸馏水中，再加无水乙醇至100mL。

2）俾士麦棕液：俾士麦棕0.5g，溶于5mL蒸馏水中，再加无水乙醇至100mL。

3）伊红Y液：伊红Y 0.5g，溶于5mL蒸馏水中，再加无水乙醇至100mL。

临用前，将上述亮绿液45mL,伊红Y液45mL，俾士麦棕液10mL混合后，再加磷钨酸0.2g，饱和碳酸锂水溶液1滴。

也可配制EA50液

3%亮绿水溶液10mL　　　　　　　　无水甲醇250mL

20％伊红Y水溶液20mL　　　 　　　冰醋酸20mL

磷钨酸2g（水溶后加入）95％　　　乙醇700mL

2．染色步骤

（1）将固定后的涂片入水、苏木精染核（5～10min）、自来水洗（1min）、盐酸乙醇分化（数分钟至30 s ）、流水冲洗返蓝（1min）。

（2）70％、80％、95％乙醇逐级脱水各1min。

（3）橙黄-G6　3～5min。

（4）95％乙醇Ⅰ、Ⅱ缸洗各1min。

（5）EA36或EA505min。

（6）95％乙醇Ⅰ、Ⅱ缸洗各1min。

（7）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ缸洗各1min。

（8）二甲苯Ⅰ、Ⅱ缸透明各1min。

（9）中性树胶封固。

3．结果　巴氏染色法将胞核染为深蓝色；鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈橘黄色（图4-10～图4-13）；高分化鳞癌细胞可染成粉红色或橘黄色；腺癌胞质呈灰蓝色；中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；红细胞染粉红色，黏液染成淡蓝色或粉红色。

图4-10　宫颈鳞状上皮细胞（巴氏染色10×10倍）

图4-11　宫颈鳞状上皮细胞（巴氏染色10×10倍）

图4-12　宫颈鳞状上皮细胞（巴氏染色10×10倍）

图4-13　宫颈鳞状上皮细胞（巴氏染色10×10倍）

（三）绍氏（Shorr）染色法

1．染液配制

猩红　　　0.5g

橘黄　　　0.25g

固绿　　　0.075g

磷钨酸　　0.5g

磷钼酸　　0.5g

50％乙醇　100mL

冰醋酸　　1.0mL

以上各种原料依次加入乙醇内溶解，最后加入冰醋酸，待全部溶解后即可使用。

2．染色步骤

（1）将固定好的涂片放入绍氏染液染色2min。

（2）70％乙醇洗去多余染液。

（3）分别经80％、95％、无水乙醇中分化和脱水。

（4）二甲苯透明。

（5）中性树胶封固。

3．染色结果　细胞核染蓝色，表层细胞胞质呈红色或橘红色，中层和底层细胞胞质呈淡蓝色或淡绿色。

4．绍氏染色特点　该方法对鳞状细胞的角化和非角化细胞区别非常明显，并且对其他非上皮细胞成分，如白细胞、红细胞、细菌、滴虫和精子亦区别的非常清楚。因此，常用于阴道涂片激素水平的观察。

（四）迈格吉（May-Grünwaldgiemsa，MGG）染色法

MGG由May-Grünwald染料和Giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好，因此，MGG染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。

1．染液配制

Ⅰ液　　　　　　　　迈格染料　　　　1g

甲醇　　　　　　　　　　　　　　　　100mL

在研钵内用少量纯甲醇将染料充分研磨成均匀一致的悬液，倒入烧瓶中，加入剩余的甲醇后置入37 ℃温箱4～6 h，每隔半小时研磨半小时，然后放入深棕色瓶内，在室温下保存，2周后使用。临用前取上液40mL，加纯甲醇20mL混合用作工作液。

Ⅱ液　姬氏染粉　　　　0.6g

甘油　　　　　　　　　50mL

甲醇　　　　　　　　　100mL

将姬氏染粉溶于甘油内，在研钵内研磨3～4 h，使之磨匀，加入纯甲醇后搅拌均匀,放入深棕色瓶内，室温下保存，2周后即可使用。

磷酸缓冲液：1％磷酸氢二钠20mL，1％磷酸二氢钠30mL，加蒸馏水至1 000mL，调整pH值为6.4～6.8（用蒸馏水代替缓冲液，效果亦佳）。

2．染色步骤

（1）自然干燥的细胞涂片（预先滴加甲醇固定更好）水平置于染色架上。

（2）滴Ⅰ液（用缓冲液或蒸馏水5～10倍稀释）盖满涂片，10～30min。

（3）倒弃涂片上的Ⅰ液，自来水漂洗干净。

（4）立即滴Ⅱ液（用缓冲液或蒸馏水5～10倍稀释）盖满涂片，染色10～30min。

（5）倒弃涂片上的Ⅱ液，自来水漂洗干净。

（6）趁湿加盖片或待干后镜检。

3．染色结果　MGG染色将细胞核染成紫红色，细胞质和核仁染成蓝紫色。

4．MGG染色特点　染色方法简单，且兼有瑞氏、姬氏两种染色的优点，并且涂片可保存十多年而不褪色。MGG染色对胞质胞核染色效果均较好，结构清晰，所染细胞亦比HE染色的细胞大；同时对细菌、霉菌及胆固醇结晶的显示也很清楚。因此，适用于淋巴造血系统的细胞标本、胸腹水、穿刺标本等。尤其对鉴别恶性淋巴瘤的类型，MGG染色更有帮助。

细针吸取细胞学（fine needle aspiration cytology，FNAC），又称针吸细胞学，是通过细针穿刺病灶,吸取少许细胞成分做涂片检查的一种细胞学诊断方法。所吸取的细胞是人为的“脱落细胞”，有时可同时吸取少许组织。国内采用的细针一般为针头外径0.6～0.9 mm的5mL 或10mL注射器，保证细针吸取的安全性，针的细度足以确保不会因为微小的损伤而引起肿瘤细胞的扩散和转移。近来细胞芯片的问世，促进了针吸细胞学的飞速发展，从而使针吸涂片后针头内剩余的少许细胞标本就可进行高通量的免疫细胞化学检查，获得大量的检查结果。

（一）优点

1.创伤小，操作简单，无须特殊设备。

2.病人痛苦少，无瘢痕形成。

3.操作安全，无副作用或意外。

4.可反复取材，病人容易配合。

5.取样迅速，制片、诊断亦较快。

6.应用范围广，几乎适用于任何部位，其他方法很难取得标本的部位，本法亦能取到，对同一肿物可做多个点穿刺。

7.重复检查，便于动态观察或疗效观察。

8.所得细胞完全是新鲜的，无自溶变性，很少人为挤压，细胞舒展，无组织切片的人为收缩,有利于镜下观察。且利于做电镜、细胞培养、免疫细胞化学及细胞芯片等较先进的辅助诊断方法。

（二）缺点

1.由于吸取物小，有一定的假阴性，即针吸细胞学阴性的病例不能完全排除恶性病变，不能完全代替病理组织学诊断。

2.有些病变主要表现为组织结构异常而非细胞异常或高分化恶性肿瘤，此时用本法诊断准确率不高。

3.虽然可鉴别肿瘤的良、恶性，但本法对某些肿瘤的分型有困难甚至不能分型。

4.对于淋巴瘤与淋巴结反应性增生的病人不易鉴别，怀疑淋巴瘤时仍会建议病人完整切除肿物做组织学病理检查来确诊。

1.浅表肿物　头面部、颈部、乳腺、甲状腺、涎腺、淋巴结、前列腺、皮下软组织和骨等。

2.胸腔肿物　肺、胸膜和纵隔等。

3.腹腔肿物　肝、胰腺、肾、腹腔内、腹膜后、盆腔内等。

病人有难以控制的咳嗽、肺动脉高压、进行性肺气肿、出血性体质及“晕针史”。

1．肿块暴露较好，操作较方便。

2．避开重要神经、血管，避开表皮破溃及溃疡的部分。

3．肿块或淋巴结较大、较硬、无液化、无坏死和继发感染。

4．同时有原发病灶和转移灶的病例，首选转移灶实施穿刺。

5．乳晕周围肿物，应避开乳晕。

（一）材料

75%乙醇、碘伏、无菌棉签、针头外径0.6～0.9 mm的5mL或10mL注射器、载玻片、无菌手套。

（二）操作步骤

1.常规消毒，包括穿刺部位和术者的双手。

2.一般部位穿刺宜尽量避免使用麻醉药。

3.穿刺者以左手拇指及示指固定肿块及其周围皮肤，右手持针，进针方向一般与体表垂直或呈45°角,沿肿块长轴方向先进皮肤，再进入肿块或淋巴结内。

4.左手固定针头，右手将注射器迅速刺入病灶或肿物内，使注射器保持负压，并在不同方向抽吸几次。

5.去负压后用消毒棉签压迫针吸点5～10min，从针管推出吸出物于载玻片上，平放针头轻轻地均匀地沿同一方向涂片，不可在同一部位来回搅拌，以免损伤细胞，涂片勿太厚。

1.穿刺时应避开表面浅静脉和深部大血管，以免引起出血或血肿。抽出液中混有血液会使穿刺液被稀释影响诊断。

2.锁骨上淋巴结穿刺时应与肩部平行或斜刺，不宜穿刺过深，以防刺破肺尖部胸膜，而造成气胸;注意勿穿入骨组织内。

3.抽出液若为干酪样物时，应另做厚涂片一张做抗酸染色查找抗酸分枝杆菌。

4.穿刺针头内偶尔可夹有微小组织，可取出送病理组织切片检查,以供对照观察。

同脱落细胞检查。

常用于针吸细胞学，即与组织病理学诊断一样做出直接明确的诊断，如乳腺髓样癌、甲状腺滤泡癌、淋巴结转移癌等。

常用于针吸细胞学以外的临床细胞学诊断。间接诊断法方法较多，如二级法、三级法、四级法、液基细胞学TBS（the bethesda system）诊断系统等。目前临床常用液基细胞学TBS诊断系统。

（一）二级法

阴性——未查见恶性细胞。

阳性——查见恶性细胞。

（二）三级法

阴性——涂片中仅为正常及炎症变性细胞。报告未查见瘤细胞。

可疑——涂片中找到一些异型细胞，不能肯定为癌细胞。报告查见可疑癌细胞。

阳性——发现肯定的癌细胞。报告查见癌细胞。

（三）四级法

阴性——涂片中仅为正常及炎症变性细胞。报告未查见瘤细胞。

异型细胞——涂片中找见异型细胞倾向于真正的间变细胞，但不能排除高度异型的炎症变性细胞及不典型的癌细胞。报告查见异型细胞。

可疑癌细胞——涂片中找到一些异型细胞，基本符合癌细胞的标准，但因数量过少或形态不典型，所以，不能排除癌细胞的可能性。报告查见可疑癌细胞。

阳性——发现肯定的癌细胞。报告查见癌细胞。

四级法报告定性明确，并且在阳性报告中注明癌细胞的组织分型；在阴性报告中亦要描述涂片中的特殊发现。如滴虫性阴道炎、胸腹水中查见大量淋巴细胞、痰中查见霉菌等。

（四） 液基细胞学TBS诊断系统

1.鳞状上皮细胞分析

（1）未见上皮内病变或恶性病变（包括与炎症有关的反应性细胞改变）

涂片中未发现异常的上皮细胞，可查到炎症细胞、红细胞、线索细胞、病原体（如滴虫、真菌孢子及假菌丝、短杆菌）等。

（2）非典型鳞状上皮细胞（意义不明确），请结合临床，建议复查

诊断标准：

●核面积为正常中层鳞状细胞核的2.5～3倍（大约35 μm）。

●核质比（N/C）轻度增高。

●核轻度深染，染色质分布或核形不规则。

●核异常伴随胞质的强嗜橘黄色改变（非典型角化不全）。

（3）非典型鳞状上皮细胞（不除外高级别鳞状上皮内病变）

诊断标准：

1)核质比高的小细胞［非典型（不成熟）化生］

●细胞单个出现，或少于10个细胞的小片。

●偶尔在常规涂片上，细胞可以“成串 ”排列在黏液中。

●细胞大小等同于化生细胞，其细胞核比正常细胞核大1.5～2.5倍。

●核质比接近HISL。

2)“密集成片型”

●为有核的密集细胞的微小活检。

●核极向可消失或分辨不清。

●浓稠胞质，多角形细胞，细胞小片的轮廓清晰锐利。一般考虑鳞状细胞而不是腺细胞（子宫颈管）分化。

(4)低级别鳞状上皮内病变

诊断标准：

●细胞单个或成片排列。

●胞质 “成熟”或为表层型胞质的细胞。

●细胞大，胞质多而成熟，边界清楚。

●核增大，核面积大于正常中层细胞核的3倍，核质比轻度增加。

●核不同程度深染，伴有大小、数量和形状的变化。

●双核和多核常见。

●核染色质均匀分布，常呈粗颗粒状，有时染色质呈煤球样或浓缩不透明。

●一般无核仁，即使有也不明显。

●核膜轻度不规则，但可光滑。

●细胞质的边界清楚。

●核周空腔（挖空细胞化）是由边界清楚的核周透亮区及浓染的边缘胞质组成，它是低级别鳞状上皮内病变的一个特征，但不是判读低级别鳞状上皮内病变所必需的。有时，胞质浓稠并呈嗜橘黄色（角化）。

●核周胞质空腔化或强嗜橘黄色的细胞，必须也同时具有核的异型性才能诊断低级别鳞状上皮内病变。

●只有核周空晕，而无核的异型性时不足以判读为低级别鳞状上皮内病变。

(5)高级别鳞状上皮内病变

●病变细胞比低级别鳞状上皮内病变的小且“不成熟”。

●细胞可以单个、成片或合胞体样聚集。

●核深染的簇团应认真评价。

●细胞大小不一，可与低级别鳞状上皮内病变细胞相近，也可以是很小的基底细胞。

●核深染，伴大小和形状的变化。

●核增大，其变化程度比低级别鳞状上皮内病变的更大。

●一些高级别鳞状上皮内病变细胞与低级别鳞状上皮内病变细胞核的大小接近，但胞质减少，使核质比明显增高。

●另一些细胞的核质比非常高，但核比低级别鳞状上皮内病变的核小得多。

●染色质可纤细或粗颗粒状，分布均匀。

●核膜轮廓很不规则并常有明显的内凹或核沟。

●一般无核仁，但偶尔可见，特别是当高级别鳞状上皮内病变累及宫颈管腺体时。

●胞质的形态多样，可表现为“不成熟”和淡染或化生性浓染。

●胞质偶尔“成熟”并浓染角化（角化性高级别鳞状上皮内病变）。

(6)鳞状细胞癌　鳞状细胞癌（SCC）定义为向鳞状细胞分化的恶性侵袭性肿瘤。

1)角化型鳞状细胞癌

诊断标准：

●细胞较少，常单个散在，聚集的细胞团较少见。

●细胞大小和形状差异大，带尾细胞核、梭形细胞常有强嗜橘黄色胞质。

●胞核大小差异也大，核膜不规则，常可见多个深染不透明核。

●染色质呈粗颗粒状，不规则的分布，有透亮的旁染色质。

●可见大核仁，但较非角化型鳞状细胞癌少见。

●角化性改变（“角化亢进”或“多形性角化不全”）可见，但若缺乏核异型，不足以判读为癌。

●可见肿瘤素质，但通常比在非角化鳞状细胞癌少见。

主要特点：液基涂片中，细胞稀少是其特点，单个肿瘤和成群细胞的形态圆，使鳞状细胞肿瘤带有腺性特点，可误判断为腺癌；可见癌性背景，但与传统涂片相比较轻微；坏死性物质常集中在细胞簇的周围，被称为 “黏附的肿瘤素质”，而传统涂片中的肿瘤素质一般分布在背景中。

2）非角化型鳞状细胞癌

诊断标准：

●细胞单个或为界限不清的合胞体样。

●细胞一般比许多高级别鳞状上皮内病变的细胞小，但有高级别鳞状上皮内病变的大多数特点。

●核染色质呈粗颗粒状，分布很不均匀。

●肿瘤素质常见，包括坏死性碎屑和陈旧性血。

●大细胞型非角化型鳞状细胞癌可显示嗜碱性胞质及大而显著的核仁。

2.腺上皮细胞分析

（1）非典型腺细胞

a.子宫颈管上皮细胞

子宫颈管上皮细胞显示细胞核的非典型程度明显超出反应性和修复性改变，但又缺乏明确的子宫颈管管原为腺癌和侵袭性腺癌的特点。

1）非特异性细胞

诊断标准：

●细胞呈片状或带状排列，细胞排列轻度拥挤，核重叠。

●核增大，为正常宫颈管细胞的3～5倍。

●细胞核的大小和形状轻度不一致。

●细胞核轻度深染。

●可见核仁。

●核分裂罕见。

●胞质尚丰富，但核质比（N/C）增高。

●细胞界限清晰。

2）倾向肿瘤细胞

细胞形态学无论在量和质上均不足以判读为子宫颈管原位腺癌或侵袭性癌。

诊断标准：

●异常细胞排列呈片状、条带状，核拥挤、重叠。

●偶见细胞团呈菊蕊团或羽毛状排列。

●核增大，染色质稍增多。

●偶见核分裂。

●核质比增高，胞质量减少，细胞境界不清。

主要特征：

●非特异性细胞液基涂片中，细胞团多呈圆形，细胞密集重叠成三维结构，很难看清楚细胞团中央的单个细胞。

●倾向于肿瘤细胞液基涂片中，细胞增厚，可呈三维结构，复层排列的细胞遮盖住团片中央部分细胞核的细节。

b.子宫内膜细胞

诊断标准：

●细胞团小，常为5～10个细胞。

●核与正常子宫内膜细胞相比，轻度增大。

●核染色稍深。

●可见小核仁。

●胞质少，偶有空泡形成。

●细胞境界不清。

主要特征：液基涂片中，核染色过深更明显；核仁更突出。

（2）子宫颈管原为腺癌　为高级别子宫颈管腺上皮病变，其特征为核增大、染色过深、复层化和核分裂增多，但无侵袭。

诊断标准：

●细胞排列呈片状、簇状、带状或菊蕊团形状，核拥挤、重叠、失去蜂窝状结构，单个异常细胞少见。

●一些细胞显示出明确的柱状形态。

●细胞团有呈栅状排列的细胞核，核及带状胞质从细胞团周边伸出（羽毛状）。

●细胞核增大，大小不一，呈卵圆形或拉长形及复层化。

●核染色过深，有均匀分布的粗颗粒状染色质是其特征。

●核仁小或不明显。

●核分裂和凋亡小体常见。

●核质比增高，胞质的量及黏液减少。

●背景干净。

●如果同时兼有鳞状上皮内病变，也可见到异常的鳞状上皮细胞。

主要特征：

●液基涂片中细胞数量不一，偶见大量异型细胞；较易发现单个完整细胞；核深染、排列拥挤的细胞团，细胞较小，较致密，常见三维结构，伴有较光滑而明确的边缘。

●假复层细胞条带经常呈“短鸟尾”样排列，可能是最突出的形态结构特点。

●出现精细的周边部羽毛状、菊蕊团及细胞条带的结构特点。

●核染色质可呈粗糙或细颗粒状，常更透亮。

●核仁可能更易见到。

（3）子宫颈管腺癌　细胞学诊断标准与子宫颈管原位癌相同，但有侵袭特征。

诊断标准：

●大量异常细胞，典型的细胞呈柱状。

●细胞可单个散在，两维片状，或三维簇团结构，合体聚集现象常见。

●核增大，核多形性，染色质分布不匀，染色质旁区空亮，核膜不规则。

●可见巨大核仁。

●胞质通常有细小空泡。

●可见肿瘤坏死素质。

●还可出现异常鳞状细胞，表明同时存在鳞状上皮内病变或腺癌伴部分鳞状上皮分化。

主要特征：液基涂片中，三维团簇很常见；核更透亮（空泡状）、染色质分布不匀，染色质旁区空亮；肿瘤素质不明显，为黏液附于异常的细胞团的细胞碎片或是凝固性坏死性碎屑。

(4)子宫内膜腺癌

诊断标准：

●细胞一般为单个或紧密的小簇团。

●高分化腺癌的细胞与非肿瘤细胞相比，细胞核仅轻度增大，并随肿瘤的级别升高而增大。

●核大小不一，核极向明显消失。

●核中度深染，染色质分布不匀，染色质旁区空亮，尤其在高级别腺癌中更明显。

●核仁明显，核仁随肿瘤的级别升高而增大。

●典型的细胞质少，嗜碱性，常有空泡。

●胞质内常见中性粒细胞。

●洗颗粒状或 “水样”肿瘤素不一定出现。

主要特征：液基涂片中三维簇团或乳头状结构常见；核较大，染色更透亮；肿瘤素可能不明显，可见细胞颗粒碎屑或凝固性坏死性碎屑黏附在异常细胞簇团周围。

组织学中：子宫颈上皮内瘤变（CIN），作为子宫颈癌前病变的统一名称，包括子宫颈上皮异型增生至原位癌的连续过程。WHO采用并推广提出宫颈诊断应采用描述性诊断和CIN分级。根据上皮异型增生的程度和范围，CIN分三级：Ⅰ级，相当于轻度异型增生，异型细胞局限于上皮层的下1/3；Ⅱ级，相当于中度异型增生，异型细胞占上皮层下1/3～2/3，细胞异型明显，核质比例增加，极性稍乱；Ⅲ级，相当于重度异型增生，异型细胞显著增多，超过上皮层的下2/3，但还未累及上皮全层，细胞核异型性大，深染；宫颈原位癌，若异型细胞占据上皮全层，但病变局限于上皮层内，未突破基底膜。