学习目标
◆了解电镜技术的原理和应用。
◆了解PCR技术的原理和应用。
◆了解荧光技术的原理和应用。
任务描述
电镜、PCR、荧光技术都是重要的病理检验技术，通过学习其原理，了解其在临床中的应用。
光学显微镜由于其放大倍数的限制，已经满足不了对细胞超微结构的观察。电子显微镜（简称电镜）是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。
电子显微镜按结构和用途分为透射式电子显微镜（简称透射电镜，transmissionelectronmicroscope，TEM）和扫描式电子显微镜（简称扫描电镜，scanningelectronmicroscope，SEM）。
（一）原理
透射式电子显微镜是以波长极短的电子束作为光源，透过样品的电子束带有样品内部超微结构信息，经过聚焦与放大后投射到荧光屏或照相底片上成像进行观察，观察的样品内部超微结构为平面图像（二维结构）。透射电镜的分辨率为0.2 nm，放大倍数为百万倍。
（二）方法
由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100 nm）。其制备过程与石蜡切片相似，经取材、固定、脱水、浸透、包埋、聚合、切片和染色等过程，但要求极严格。
1.取材 要按“快、小、轻、准”的四字原则，在机体切断血供后的数分钟内取材，组织块要小于1 mm3。
2.前固定 在0～4 ℃下，2%～4%戊二醛磷酸缓冲液中浸泡30～90min。
3.清洗 用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗10～15min，重复3次。
4.后固定 在0～4 ℃下，将组织块置于四氧化锇酸缓冲固定液中1～2 h。
5.清洗 同3。
6.脱水 依次用50%、70%、80%、100%、100%乙醇梯度脱水，各10～15min，或依次用30%、70%、90%、100%、100%、100%丙酮梯度脱水，各10～15min。
7.浸透 组织块依次浸入①纯丙酮：树脂包埋剂（1∶1），室温1 h；②纯丙酮：树脂包埋剂（1∶2），室温2 h；③纯树脂包埋剂，室温3 h以上或过夜。
8.包埋 将充分浸透的组织块置入装满包埋剂的模具中，放于37 ℃烤箱12 h，然后在60 ℃烤箱24 h。常用的包埋剂是环氧树脂。
9.切片 用特制的超薄切片机切成厚约50 nm的超薄切片。
10.染色 先后用醋酸铀和柠檬酸铅进行电子染色各30min。
（一）原理
透射电镜是以波长极短的电子束作为光源，用极细的电子束照射到样品表面进行扫描，由于电子束与样品表面的相互作用产生二次电子，二次电子带有样品表面形貌的信息，将二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，最后在荧光屏上显示物体形态，观察组织细胞表面的立体图像（三维结构）。透射电镜的分辨率为1～10 nm，放大倍数为20万～40万倍。
（二）方法
扫描电镜样品制作过程包括取材、清洗、固定、脱水、干燥和导电等过程。
1.取材 与透射电镜基本相同，组织块可稍大一些。
2.清洗 采用缓冲液、有机溶剂或酶消化等清除附着在样本表面的血液、黏液、组织液等。此步非常重要，要求十分严格，不同样品选择不同的清洗液和方法。
3.前固定 在0～4 ℃下，2%～4%戊二醛浸泡1～3 h。用戊二醛和锇酸固定1 h。
4.清洗 用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗10～15min，重复3次。
5.后固定 在0～4 ℃下，置于四氧化锇酸缓冲液中0.5～1 h。
6.清洗 同4。
7.脱水 用梯度乙醇或丙酮脱水。
8.干燥 较大的生物样本无论多么彻底的脱水仍有残余水分，不符合镜筒金属镀膜装置高真空的要求，必须进行干燥处理，由临界点干燥器完成。
9.金属镀膜 样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数，观察较大的组织表面结构。
10.观察 将样品装入扫描电镜的样本室中进行观察。
1.在穿刺活检方面的应用 电子显微镜在慢性肾病、肝代谢性疾病诊断中的作用是值得肯定的，用得最多的是肾活检的诊断。电镜除了能精确区分肾小球内各种细胞及组织成分外，还可观察到光镜所不能见到的这些成分的超微结构病变，特别是上皮细胞、系膜、基膜细胞和间质的改变，确定有无电子致密物的沉积及其沉积部位，对肾病的分型提供了可靠的形态学支持。
2.在肿瘤诊断中的应用 在肿瘤病理诊断中，主要通过对超微结构的观察及寻找各类组织特有的细胞分化标记，从而确诊和鉴别相应的肿瘤类型。利用电镜观察细胞的超微结构病理变化和细胞凋亡情况，为肿瘤的临床诊断和治疗提供了重要科学依据，有利于深入地认识肿瘤的生物学特性、发病机制及其进展和预后。
3.在血液系统疾病诊断中的应用 在电子显微镜下观察白血病瘤细胞的特殊结构和形态特点的超微结构，是诊断白血病的主要依据，这是光学显微镜无法达到的。尤其是临床表现不典型时，再结合扫描电镜（表面微绒毛）更加有其诊断价值。在贫血的鉴别诊断中，可以利用透射电镜加扫描电镜方便地鉴别出各种类型的贫血，如缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血等。
4.在肌肉活检中的应用 一般的肌肉疾病可通过肌肉组织化学染色，基本可以满足各种神经肌肉病、遗传性肌病的诊断与鉴别诊断。但是，对于一些少见、罕见的神经肌肉疾病，还需要进一步行肌肉超微结构或免疫电镜检查，尤其是各种代谢性疾病、线粒体肌病和各种先天性肌肉疾病等，电镜对这些主要类型疾病的诊断有不可替代的作用。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在DNA解旋酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶基因序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93 ℃左右一定时间后，模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 ℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶基因序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性→退火→延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3 h 就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 μL
4种dNTP混合物 200 μL
引物 10～100 μL
模板DNA 0.1～2 μg
Taq DNA聚合酶 2.5 μL
Mg2+1.5 mmol/L
加双蒸或三蒸水100 μL
参加PCR反应的物质主要有五种,具体要求:
1.引物即5′端引物和3′端引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
（1）引物长度：18～30 bp，常用为20 bp左右。
（2）引物碱基：G+C含量以40%～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（3）引物内部不应出现互补序列。选择50%的C+G和无4个连续相同的碱基的引物。
（4）2个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3′端的互补重叠。
（5）引物与非特异扩增区的序列同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
（6）引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。
（7）引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。
2.PCR所用的酶主要有两种来源：Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq DNA聚合酶扩增效率高但易发生错配。Pfu DNA聚合酶扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要做不同的选择。
3.模板可以是DNA，也可以是RNA。但有两个原则：第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。靶模板核酸通常提取于体液和组织标本中的细胞内或是呈游离状态，靶标本中含有大量的蛋白质和脂类物质对PCR有抑制作。因此，多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀PCR，这样纯化的核酸水溶液即可作为DNA模板用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
4.dNTP dNTP的质量与浓度影响PCR的扩增效率。应先配制成高浓度，小量分装置-20 ℃ 冰冻保存，避免反应多次冻融，否则会使dNTP降解。
5.缓冲液 成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性（90～96 ℃） 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
2.退火（25～65 ℃） 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70～75 ℃） 在Taq DNA聚合酶（在72 ℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端→5′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每经过变性、退火和延伸循环一次，DNA含量即增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq DNA聚合酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此，可以改为两步法，即退火和延伸同时在60～65 ℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
4.反应的控制
（1）PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子。
（2）镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5 mmol/L。
（3）底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200 μmol/L。
（4）Taq DNA聚合酶 2.5 U（100 μL）。
（5）引物 浓度一般为0.1～0.5 μmol/L。
（6）反应温度和循环次数
变性温度和时间：95 ℃，30 s。
退火温度和时间：低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55 ℃。
延伸温度和时间：72 ℃，1min/kb（10kb内）。
Tm值=4（G+C）+2（A+T）
循环次数：循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
PCR反应扩增一定的拷贝数，应进入检测环节。目前最常用的检测方法是荧光素（溴化乙啶，EB）染色凝胶电泳，其简捷易行。但电泳法检测特异性较差，引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。近年来以荧光探针为代表的检测方法，特异性较高，有逐渐取代电泳法的趋势。
1.特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：①引物特异性好，能与模板DNA正确的结合；②碱基配对原则；③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
2.灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（1 μg=10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3.简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性→退火→延伸反应，一般在2～4 h完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
4.对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等进行DNA扩增检测。
1. 肿瘤的诊断和分型 癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。目前应用最多的人乳头瘤病毒（HPV）的定量测定和分型检测。
一些病毒致癌作用也与病毒载量有关，EB病毒载量的FQ-PCR检测结果已被用于鼻咽癌早期发现和疗效观察。
2. 感染性疾病的诊断和治疗观察 PCR在医学检验学中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR就可以检测到。一般实验室也能检出10～100基因拷贝，而目前病原体抗原检测方法一般需要105～7个病原体才可检测到。PCR对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
定量PCR技术可检测病人病原体的数量，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。
3.遗传病的诊断 PCR技术首次临床应用就是从检测镰状细胞和β-地中海贫血的基因突变开始的。基因的突变和缺失均会引起各种珠蛋白的表达不平衡，用FQ-PCR检测各种珠蛋白基因表达差异，是地中海贫血诊断的有效手段。
4.亲子鉴定 PCR技术可用于亲子鉴定，判定父母与子女之间是否具有亲生关系。
5.法医鉴定 检测血迹、毛发、精斑等基因序列测定，锁定嫌疑犯。
将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
（一）直接法
将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
（二）间接法
如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原-抗体-抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其他步骤的抗原检查相同。
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种属特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
（一）直接免疫荧光法
1.基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。
2.试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01 mol/L，pH值7.4。
荧光标记的抗体溶液：以0.01 mol/L，pH值7.4的PBS进行稀释。
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH值9.2 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液1份配制。
搪瓷桶三只（内有0.01 mol/L，pH值7.4的PBS 1 500mL）、有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）、荧光显微镜、玻片架、滤纸、37 ℃温箱等。
3.操作步骤
（1）滴加0.01 mol/L pH值7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
（2）滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。
（3）取出玻片，置玻片架上，先用0.01 mol/L pH值7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01 mol/L pH值7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5min，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
（5）立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；
（±）极弱的可疑荧光；
（+）荧光较弱，但清楚可见；
（++）荧光明亮；
（+++～++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
4.注意事项
（1）对荧光标记抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1∶20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
（2）染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10min到数小时，一般30min已足够。染色温度多采用室温（25 ℃左右），高于37 ℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0～2 ℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37 ℃ 30min效果好得多。
（3）为了保证荧光染色的正确性，首次试验时须设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
1）标本自发荧光对照：标本加1～2滴0.01 mol/L pH值7.4的PBS。
2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
（4）一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
（二）间接免疫荧光法测抗体
1.基本原理 染色程序分为两步：第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37 ℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。
2.试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01 mol/L，pH值7.4。
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH值9.2 0.2 mol/L碳酸盐缓冲液1份配制。
荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01 mol/L，pH值7.4的PBS进行稀释。
搪瓷桶三只（内有0.01 mol/L，pH值7.4的PBS 1 500mL）、有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）、荧光显微镜、玻片架、滤纸、37 ℃温箱等。
3.实验步骤
（1）滴加0.01 mol/L pH值7.4的PBS于已知抗原标本，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2）滴加以0.01 mol/L pH值7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37 ℃保温30min。
（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01 mol/L pH值7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01 mol/L pH值7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。
（5）将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37 ℃保温30min。
（6）重复操作（3）。
（7）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
（8）荧光显微镜高倍视野下观察，结果判定同直接法。
4.注意事项
（1）荧光染色后一般在1 h内完成观察，或于4 ℃保存4 h，时间过长会使荧光减弱。
（2）每次试验时，需设置以下三种对照。
1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物。
2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物。
3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
（3）已知抗原标本片在操作的各个步骤中始终保持湿润，避免干燥。
（4）所滴加的待检抗体标本或荧光标记物，应始终保持在已知抗原标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。
1.快速检测病原体，也可检测患者血清中特异性抗体水平。
2.自身抗体检测：用于检测血中抗核抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体等自身抗体。
3.免疫病理检测：检测组织中免疫球蛋白、补体、抗原抗体复合物，以及肿瘤组织中肿瘤相关抗原的鉴定。
4.细胞表面抗原和受体检测，可用于淋巴细胞表面CD抗原、抗原受体、补体受体、Fc受体等的检测，以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。
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