人参皂苷与川芎嗪合用对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

人参皂苷与川芎嗪合用对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

随着溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)等新技术的广泛开展,心肌IR损伤日益成为科研的热点。近年来发现其与血清肿瘤坏死因子α( TNFα)、一氧化氮(NO)之间存在着密切联系。本课题着重考察人参皂甙(GS)和川芎嗪(TMP)合用对心肌IR损伤的保护作用及其对IR期间TNFα和NO释放的影响。

一、材料与方法

(一)实验动物与分组

选取健康雄性成年家兔35只,体重为2.5kg±0.5kg。实验前随机分为5组:①模型对照组,简称Model组(0.9%NS5ml,iv),n=7;②维拉帕米(德国基诺药厂巴斯夫中国有限公司产品,5mg/2ml,批号970115)治疗对照组,简称Ver.组(0.25mg/kg,iv),n=7;③川芎嗪(无锡市第七制药厂产品,40mg/2ml,批号970418)治疗对照组,简称TMP组(40mg/kg,iv),n=7;④人参皂甙(安徽中医学院第一附属医院制剂室提供,2g/10ml,批号97040)治疗对照组,简称GS组(0.2g/ kg,iv),n=7;⑤人参皂苷与川芎嗪合用治疗组,简称GS+TMP组(0.2g/kg和40mg/kg依次iv),n=7。

(二)实验过程

1.步骤 家兔称重后依次经耳缘静脉注射20%乌拉坦溶液(1g/ kg)、肝素钠溶液(500U/kg)进行麻醉与抗凝,然后固定于手术台上,取仰卧位,接上ECG电极(标准肢体Ⅱ导联),与RM86型八道生理记录仪相通。一个6F心导管(注入肝素溶液)插入左侧股静脉供药物注射使用;7F心导管(注入肝素溶液)经右侧颈静脉插至冠状静脉窦处,供取血用;另一个6F心导管(注入肝素溶液,经3路开关接压力换能器,再通过载波放大器与RM86型八道生理记录仪相通)沿左侧颈总动脉插入左心室,监测与记录左心室内压(LVP)波形和左室内压变化速率(±dp/dt)波形。

2.心肌

IR模型制作 剪毛,沿胸骨左缘第三、四肋间开胸,不弄破胸膜,维持自主呼吸,剪开心包,制作心包吊床,分离左冠状动脉前降支(LAD),缺血前15min时静脉注射实验药物,于LAD中上1/3处(第一分支后),穿线结扎(ST段升高大于2mv标志结扎成功), 15min后剪开结扎线(ST段骤降标志再灌注成功),再灌注60min。

(三)实验指标的记录与测取

通过RM86型八道生理记录仪记录各组发生RA的时间、类型和各组缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min时LVP曲线及曲线,测出左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)和dp/dtmax数值;并分别在以上各时间点抽血2~3ml检测血清TNFα、NO值(分别由安徽中医学院经络研究所同位素室及生化室测定)。实验完毕后,立即取下心脏,用生理盐水冲洗干净,在心脏结扎线以下,平行于冠状沟沿心脏长轴均匀地将心室肌横断切成5片,然后置于1%红四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH7.4)中浸,37℃染色15min,坏死心肌不着色,存活心肌显砖红色。用滤纸吸干心肌表面的水分,称取左室心肌与梗死心肌湿重,以梗死心肌湿重占左室心肌湿重的百分比来表示梗死范围。

(四)室性心律失常的分类标准

室性心律失常按Lambeth标准分为室性纤维颤动(VF)、室性心动过速(VT)和仅有室性期前收缩(VPB)三类,其中VPB又根据Lown和Wolf标准分Ⅰ级(偶发,<1bpm或30bph)、Ⅱ级(频发,> 6bpm或30bph)和Ⅲ级(多源)。按危险性由低到高分为VPBⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级、VT、VF5级,如果同时出现两个及以上级别的室性心律失常,则将其归入级别最高的那一类。

(五)统计学方法

所有数据均以均值±标准差( x±s)表示,计量资料采用t检验,计数资料采用x检验,等级资料采用Ridit分析及U检验。

二、结果

35只家兔中,有3只在再灌注过程中因VF而死亡,其中Model组2只,TMP组1只。

(1)各组家兔在缺血前、缺血15min、再灌注30min及60min时由冠状静脉窦取血检测TNFα、NO水平 结果(详见表1)显示,各组缺血前TNFα、NO值无明显差异(P<0.05),除NO在缺血15min时均有所下降外,其他时间点两者均持续升高,以再灌注60min时最为显著(P<0.001),而各组之中又以Model组增高为甚,同Model组相比,GS+TMP组差异性最大(P<0.001)。

表1 各组家兔缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min时血清TNFα、NO变化情况(x±s)

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;vsModelgroup:△P<0.001;vspreischaemia。

(2)再灌注后,所有家兔均在5min内出现各种室性RA(详见表2) 通过Ridit分析及U检验发现,同Model组相比,只有GS+ TMP组和Ver.组能够显著降低RA的危险程度,而GS组和TMP组无显著性差别。

表2 各组家兔在再灌注期间发生RA的情况

注:Ridit:*P<0.05vsModelGroup。

(3)左室舒缩功能参数值比较 心肌缺血前各组的左室舒缩功能参数值无明显差异(P>0.05),缺血15min时均有明显减退,再灌注30min时这一变化尤为显著,随后各组(除Model组外)舒缩功能虽有所恢复,但同缺血前相比,仍有显著差别(P<0.001)。同Model组相比,再灌注后各组收缩功能的减退程度均较之为小,但具有统计学意义的只有GS组(P<0.05)和GS+TMP组(P<0.01);各组舒张功能的减退程度亦较之为小,且都有统计学意义,按显著性由大到小的顺序依次是Ver.组>GS+TMP组>MP组>GS组,详见表3。

表3 各组家兔在缺血前、缺血15min、再灌注30min和60min时LVSP、±dp/dtmax和LVEDP变化情况(x±s)

续表

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,vsModelgroup;△P<0.001vspreischaemia。

(4)通过1%TTC染色后发现各组家兔心脏的左室前壁均出现心肌梗死。心肌梗死范围(见表4)以Model组最大,与之相比,GS+ TMP组心肌梗死范围最小(P<0.001),其次是GS组、Ver.组和TMP组(P<0.05)。

三、讨论

心肌

IR损伤除与“钙超载”“氧自由基”和“无复流现象”等因素密切相关外,近年来还发现,TNFα和NO与心肌IR损伤之间有着密切联系。

(1)TNFα ①能减弱心肌的收缩力;②能刺激血管内皮细胞和中性粒细胞(PMN)表达表面黏附因子,促进PMN聚集,从而不仅增加了RA的发生率,而且还有助于PMN释放活性氧和蛋白水解酶等物质,加重RI程度;③尚能刺激诱生型NO合成酶(inducible NOS,iNOS)合成释放大量的NO,后者又可与超氧负离子迅速反应生所过氧亚硝酸根(ONOO-),并进一步产生氧化能力更强的羟自由基(OH-),致使组织损伤加重。

(2)iNOS 目前研究证实, IR期间cNOS活性降低,iNOS活性却显著增高,大量释放的NO是由iNOS合成的。后者不仅能通过上述自由基途径发挥破坏效应,而且能够减弱心肌舒缩功能,其机制可能是:①过量产生的NO使组织cGMP产生增加,激活cGMP依赖性蛋白激酶,减少细胞钙内流,抑制心肌收缩功能;②也可通过非cGMP依赖性途径,激活胞浆内ADP核糖基转移酶,催化ADP核糖基转移到3磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH),抑制糖酵解供能。

急性心肌梗死(AMI)属于中医胸痹心痛范畴,其病机主要是气虚血瘀,而临床上心肌IR常发生于AMI期。根据中医辨证施治原则,中药防治心肌IR损伤宜使用益气活血法。因此,我们从众多临床制剂中将GS与TMP注射液筛选出来并加以组合运用,来考察两者对家兔心肌IR损伤的保护作用。实验结果表明,GS和TMP合用能显著降低RA的危险程度,IR期间左室舒缩功能的减退(心肌顿抑主要表现为左室舒缩功能的低下)及再灌注后心肌梗死的范围,还能显著抑制IR期间TNFα和NO的大量释放,且作用比单用及使用Ver.更显著。因此,我们得出以下结论:①GS+TMP合用较单用对心肌IR损伤有着更为显著的保护作用。这一事实说明,依据中医辨证施治原则选取药物,不仅有助于挖掘、筛选中药及其提取物,而且还显著提高了临床疗效。②GS+TMP对IR期间TNFα和NO大量释放的抑制程度与其对心肌IR损伤的保护作用之间存在着相平行的关系,表明它们除了能通过阻止心肌细胞内钙超载的出现,降低氧自由基的产生及改善心肌微循环等途径以外,还能通过显著抑制TNFα和NO的大量释放,来发挥其对心肌IR损伤的保护作用。至于GS+TMP是直接抑制iNOS合成NO,还是通过抑制TNFα来减少iNOS合成NO,尚有待于进一步研究。

表4 各组家兔再灌注后心肌梗死范围(x±s)

注:^*P<0.05***P<0.001,vsModelgroup。