阿尔茨海默病动物模型的建立及智脑胶囊干预作用的研究

阿尔茨海默病动物模型的建立及智脑胶囊干预作用的研究

大量的研究表明,缺乏既能反映阿尔茨海默病(Alzheimer病, AD)行为学改变,又能出现典型的AD神经病理学特征的AD动物疾病模型,是阻碍AD进一步深入研究的症结所在。本实验在参考国外文献的基础上,改进并成功制作出既有AD的行为学改变,又有反映AD病理变化的β淀粉样蛋白(βAP)沉积的AD大鼠模型,并观察了中药复方智脑胶囊对实验性AD模型大鼠行为学改变(学习、记忆等)、脑组织病理学变化(βAP沉积)等指标的干预效应,以探讨智脑胶囊的作用机理。

一、材料与方法

1.动物 Wistar雄性大鼠,体重250~300g,购于安徽省医学研究所医学实验动物中心。适应性喂养1周,饲料为市售固体饲料(购于安徽医科大学实验动物中心),饮自来水。除实验时外,可自由摄食和饮水。

2.药物 智脑胶囊(由黄精、党参、川芎、石菖蒲等中药组成,每粒0.5g,相当于生药3g,由安徽中医学院第一附属医院制剂室提供),配制成水溶液,实验时稀释至所需浓度;脑复康(上海信谊药厂产品),配制成100mg/ml溶液。均4℃保存,灌胃时温服。

3.主要试剂β淀粉样肽(1~40)和兔抗β2淀粉样肽(1~40)单克隆抗体,均为美国Sigma公司产品;抗生物素蛋白生物素过氧化物酶标准试剂盒(ABC标准试剂盒)及二抗生物素化抗体羊抗兔,为美国Vector公司产品;二氨基联苯胺(DAB)由吉泰公司提供(美国Vector公司产品);转移生长因子β1( TGFβ1)为华美公司产品;其他试剂均为市售分析纯或化学纯试剂。

4.主要仪器 恒冷箱切片机,美国DAMON/IECDIVISION制造;高速台式离心机,上海医疗器械品厂生产;721分光光度计,上海第三分析仪器厂出品;NikonE800显微图像分析系统,日本Nikon公司产;江湾IC型立体定位仪,上海第二军医大学仪器厂生产。

二、实验过程

1.动物分组 Wistar大鼠,随机分为正常组、假注射组、模型组、模型加脑复康对照组(简称“阳性药组”)和模型加智脑胶囊Ⅰ组(2g·kg^-1·d^-1)和Ⅱ组(4g·kg^-1·d^-1)(简称智脑Ⅰ组、智脑Ⅱ组),每组10只。

2.动物模型制备 参照Nabeshima和Frautschy的方法并进行改进,具体方法如下:3%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射,麻醉大鼠,将鼠头固定于江湾IC型立体定位仪上保持前后囟在同一水平,剪开头发,暴露前囟,按大鼠脑立体定位图谱进行定位,在前囟点后方112mm,中线旁开210mm,用PK500牙科钻钻一小孔,垂直插入一小塑料管(PE210,美国),深度为4mm(达侧脑室),将小管固定于大鼠头顶骨,局部撒复方新诺明药粉防止感染,缝合头皮,术后肌肉注射青霉素每只8万U/d。模型组每只侧脑室内给予βAP2μg/d,连续14天。同时,于首次实验时在大鼠背侧丘脑(211mmAP,+114mmML和-416mmDV),用微量进样器显微注射转移生长因子β110ng1次,注射5min,留针3min。假注射组给予等体积的人工脑脊液,手术中注意动物呼吸(避免呼吸道阻塞)、体温(用动物体温维持仪保持动物体温)。在βAP末次注射7天后进行大鼠被动回避条件反应和空间学习记忆力测试。

3.给药方法 造模成功后(通过行为学测试及病理学观察证实),开始给药。智脑胶囊两组分别给予大鼠智脑胶囊水溶液2g/kg体重、4g/kg体重灌胃,正常组、模型组均给予等容积的生理盐水灌胃;而阳性药组灌胃脑复康混悬液100mg/kg体重,连续28天。

4.指标观察及测定 ①一般情况:包括大鼠神志、活动、毛发、饮食等。②学习记忆指标:在侧脑室βAP末次注射7天后,分别采用避暗法和水迷路法,观察大鼠学习记忆能力,以大鼠在明室停留时间超过300s为判定标准,观察大鼠在有灯的明室内的停留率,每天训练10次,连续5天,第6天测试。水迷路实验,大鼠训练以90s为限,若在此时限内动物不能到达平台,则训练停止并记录成绩为90s,每天2次,连续5天。以大鼠自放入水中至找到平台时间作潜伏期,灌胃28天后,重复上述方法进行复测。③实验性AD模型大鼠大脑皮层、海马结构CA1区βAP沉积斑数目和截面积:在βAP末次给药后12天(即行为学实验进行后),取βAP侧脑室注射大鼠6只,作脑组织形态学观察,了解大脑层、海马有无βAP沉积斑。并和正常组(4只),假注射组(4只)对照观察,以了解造模是否已造成大鼠大脑病理形态学改变。取造模成功的大鼠连续灌服中药智脑胶囊28天后进行行为学指标复测,并观察智脑胶囊对实验性AD模型大鼠大脑皮层、海马CA1区βAP沉积的影响。具体方法为先将大鼠称重麻醉,剪开胸腔,暴露心脏,主动脉灌流,先以0.9%生理盐水100ml快冲,继之以4%多聚甲醛(pH7.4)灌流30min,至动物尸体展开,肢体变硬为止。取出大脑,置4%多聚甲醛/0.1MPB中,后固定6h,再分别移至10%、20%、30%蔗糖/0.1MPB中,每步均以沉淀为准;恒冷箱连续切片,片厚20μm,3张取1张。开始作免疫组化,在脑片上滴加0.3% H2O₂30min;5%小牛血清白蛋白(BSA)、1%大鼠血清及1%山羊血清,共同孵育20min;滴加按1∶100稀释的兔抗人βAP(1~40)单克隆抗体,每次均取2张脑片作阴性对照,4℃过夜;滴加生物素标记的二抗(山羊抗兔IgG1∶250)孵育切片1h;加ABC复合物(1∶100, 10μg/ml抗生物素蛋白+215μg/ml生物素过氧化酶)45min;DAB/ H2O₂/CoCl₂/NH4NiSO₄(除H2O₂按1∶100配制外,余则按1∶50配制)室温显色为黑色,边加样边观察,镜下出现黑色,入水终止反应,超出30min,即染不出。注意上述步骤自切片后做免疫组化开始,每步之后均用PBS洗涤,系列酒精脱水,二甲苯透明封片。在光镜下进行脑片观察,按包新民等主编的大鼠脑立体定位图谱,对选取的大脑顶部皮层、海马CA1区进行定位(同一区域切片组织块三维定位相同),随机选取相同张数的脑片在光镜下观察形态,并在NikonE800显微图像分析系统下对大脑皮层、海马CA1区βAP沉积斑作定量分析,计算每平方毫米βAP沉积斑数目和截面积(μm2)。④统计学方法:配对资料采用t检验。

三、结果

1.一般情况观察 模型组与其他组比较,大鼠活动减少,体毛少泽,晦暗不顺,神情呆滞,反应欠灵,食欲减退。

2.智脑胶囊对AD模型大鼠学习记忆的影响 ①βAP侧脑室注射对大鼠空间辨别学习记忆能力的影响:(具体见表1)假注射组和正常组在水迷路中潜伏期均值上无明显差异,表明注射本身对实验结果无影响。模型组和正常组、假注射组比较,其潜伏期明显延长,以测试第3、4、5天最为明显,差异有显著性(P<0.05或P<0.01);显示随测试时间延长,βAP损害作用愈加明显,表明βAP侧脑室注射可造成大鼠明显空间辨别学习记忆的障碍。②βAP侧脑室注射对大鼠被动回避反应的影响:用避暗法观察所得结果显示,模型组大鼠的明室停留率(35.3%)明显低于正常组(93.5%)和假注射组(86.4%);模型组与正常组和假注射组比较差异有显著性(P<0.01);而正常组与假注射组比较无明显差异(P>0.05),表明模型组已造成大鼠学习记忆能力下降。③智脑胶囊对实验性AD模型大鼠空间辨别学习记忆能力的影响:(具体见表2)模型组和正常组比较,有显著的空间辨别学习记忆能力障碍。随着测定天数的后延,其表现得更为明显。与模型组比较,阳性药组对大鼠空间学习记忆有一定改善作用,但以第5天明显(P<0.05)。而智脑胶囊两剂量组可明显改善实验性AD模型大鼠空间辨别学习记忆障碍,差异有显著性(P<0.05或P<0.01),且作用优于阳性药组,但智脑胶囊两组间无统计学差异。④智脑胶囊对实验性AD模型大鼠被动回避反应的影响:用避暗法观察结果表明,正常组、模型组、阳性药组、智脑Ⅰ组、智脑Ⅱ组的明室停留率分别为92.6%、28.7%、60.5%、73.3%、86.0%。智脑胶囊两剂量组均能明显提高大鼠明室停留率,与模型组比较,差异有显著性(P<0.05或P<0.01);与正常组比较,其跳台停留率虽不及正常组,但无明显统计学差异。阳性药组与模型组比较,差异也有显著性(P<0.05)。智脑Ⅱ组与阳性药组比较,差异有显著性(P<0.05);表明智脑Ⅱ组药效优于阳性药组。

表1βAP侧脑室注射对大鼠空间辨别学习记忆能力的影响(x±s)

注:与正常组比较*P<0.05,**P<0.01。

表2 智脑胶囊对实验性AD模型大鼠空间辨别学习记忆能力的影响(x±s)

注:与正常组比较*P<0.05,^**P<0.01,与模型组比较,^△P<0.05,^△△P<0.01与阳性药组比较,▲P<0.05。

⑤智脑胶囊对实验性AD模型大鼠大脑皮层、海马结构CA1区βAP沉积的影响:(具体见表3)模型组在大脑皮层、海马等处出现有明显的βAP沉积斑等特征性病理变化,而正常组和假注射组大鼠免疫组化染色未见明显βAP阳性斑块。模型组在大脑皮层、海马CA1区可见许多散在Ⅱ~Ⅲ型淀粉样蛋白沉着(其分型标准为:Ⅰ型为碎片样沉着;Ⅱ型为均质的淀粉样蛋白沉着斑;Ⅲ型为中心有核,核周围有晕的蛋白沉着斑),偶可见呈梭形和锥形βAP阳性反应神经元。大鼠灌胃药物28天后,智脑Ⅰ组和阳性药组大鼠大脑皮层、海马结构CA1区βAP沉积斑数目及截面积减少,但差异无显著性。而智脑Ⅰ组与模型组相比较,上述数值差异显著(P<0.05),智脑Ⅱ组与模型组及阳性药组比较,上述数值亦存在显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而阳性药组与模型组比较虽有减少,但差异无显著性。

表3 智脑胶囊对实验性AD模型大鼠大脑皮层、海马结构CAI区βAP沉积斑数目和截面积变化的影响(x±s)

注:与模型组比较*P<0.05,**P<0.01;与阳性药组比较,△P<0.05。

四、讨论

研制理想的AD动物模型是近年来AD研究的热点。由于AD病因学多因异质的特点,近年来虽然复制出许多AD动物模型,但多数未能很好反映或较接近反映AD患者的临床全貌而仅模拟了AD的行为学改变,对反映AD主要病理特征却未能在模型中较好地加以解决。

βAP沉积学说是当今公认的造成AD的关键病因学说。据此,国外学者采用βAP侧脑室输注造成AD动物模型,并认为这一模型是转基因AD模型的有益补充,但存在着造模方法复杂、稳定性差、成功率不高等诸多不足。由于βAP(1~40)是体内淀粉样肽的主要形式之一,其可溶性较βAP(1~42)强,是啮齿类动物SP的主要成分,同时因动物体内存在着βAP的清除机制,而后者往往是啮齿类动物造模包括转基因动物模型缺少产生βAP沉积的原因之一。故使用TGFβ1可抑制βAP的清除。因而上述试剂在本实验中被选用。此外,由于雌激素有抗AD作用对造模不利。故实验所选动物以雄性或老年雌性鼠为宜。本研究在参考国外文献的基础上,经过改进,成功地制作出既有大鼠行为学变化,又有脑内βAP沉积的神经病理学改变的AD大鼠模型。这显示了该AD模型大鼠的上述改变与临床较为接近,且具良好的稳定性、较高的成功率和较短的制作周期,从功能和形态两方面为AD药物机理及筛选研究提供具有较高实用价值的动物模型。

本研究以上述AD模型大鼠为研究对象,观察了智脑胶囊对该模型大鼠一次性被动回避反应和空间辨别学习记忆能力的影响。结果显示,智脑胶囊能明显缩短模型大鼠平均潜伏期,提高模型大鼠明室停留率。与AD模型组比较,差异有显著性;且药效优于脑复康阳性药组,表明智脑胶囊可改善实验性AD模型大鼠学习记忆能力,有助于AD的临床治疗。

大量研究表明,AD是一种中枢神经系统βAP沉积症,且淀粉样蛋白沉积数量的多寡与AD严重程度呈正相关。本研究结果显示,实验性AD模型大鼠皮层、海马CA1区有明显的βAP沉积。治疗后,智脑胶囊两组均能显著减少上述区域内βAP沉积斑数目和截面积,表明智脑胶囊可抑制和清除实验性AD模型大鼠大脑皮层和海马CA1区的βAP沉积,改善与学习记忆等密切相关的皮层、海马CA1区神经元功能,达到易化学习记忆的目的。