显微镜的使用和临时病原玻片的制作

一、目的要求

了解常用光学显微镜的结构性能，正确掌握显微镜的使用方法，学习临时病原玻片的制作方法。

二、材料和用具

（一）病害标本

1.十字花科蔬菜霜霉病（Peronospora parasitica）标本

2.菜豆锈病（Uromyces appendiculatus）标本

3.枇杷灰斑病（Pestalotia funerea）标本

4.甘薯黑斑病（Ceratocystis fimbriata）标本

5.蚕豆花叶病毒病（Broad-bean true mosaic virus）标本

以上材料均为新鲜病害标本，前4种发病部位要求具有明显病征。

（二）实验用具

显微镜、接目测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸、纱布、镊子、挑针、剪刀、刀片、通草等。

三、内容和方法

（一）显微镜的使用

1.显微镜的结构

病原微生物个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和结构。 显微镜有多种，如光学显微镜（包括明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、干涉显微镜、荧光显微镜等），电子显微镜（包括透射电子显微镜、扫描电子显微镜），它们的用途各不相同。 这里只介绍常用的普通光学显微镜，它的结构主要包括光学部分和机械部分（图2-1）。

图2-1 光学显微镜结构示意图

（1）光学部分

光学部分包括物镜、目镜、镜筒、聚光器和反光镜等。

①物镜：即接物镜，是显微镜上最重要的光学部分。 物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。 各种物镜上都刻有放大倍数，如“8×”“10×”为低倍镜，“15×”“20×”“25×为中倍镜，“40×”“45×”为高倍镜，“90×”“100×”为油镜。 油镜是指物镜和盖玻片之间必须用香柏油或液体石蜡作为介质，而其他物镜与盖玻片之间是以空气作为介质的。

②目镜：即接目镜，也是显微镜上重要的光学部分。 目镜上同样刻有放大倍数，如“10×”“16×”等。

观察物体的理论放大倍数＝目镜放大倍数×物镜放大倍数。

③聚光器：位于载物台通光孔下方，其作用是聚集反光镜反射来的光线，并将其射入物镜和目镜，增加观察标本的亮度。 聚光器可以通过螺旋上下调节，向上调，亮度加强，向下调则减弱。

聚光器下部有虹彩光圈，推动其把手，可以控制聚光器口径大小，调节光的亮度。 当自然光或照明用具光强时，缩小光圈，光弱时则放大光圈。 虹彩光圈下部有一个金属圆圈，可以放置滤光玻片，以改变光源的色调。

④反光镜：显微镜下部的一个圆镜，它可以朝任何方向转动，用镜面收集光线，通过聚光器，将光线反射到物镜。 反光镜有平、凹两个面，凹面反光强于平面。

（2）机械部分

机械部分包括镜头转换器、粗（细）调节螺旋、载物台、镜臂、倾斜关节、镜座等。

①镜头转换器：上接镜筒，在镜头转换器上的螺纹圆孔可以安放不同放大倍数的物镜。 旋转镜头转换器可以使用不同物镜。

②载物台：方形或圆形，供放置玻片标本，中央为通光孔，与聚光器相对。 左右有一对具弹性的压夹，用于固定载玻片。 一般载物台上还安装有推动器，以便横向或纵向移动玻片。

③粗、细调节螺旋：粗调节螺旋是镜臂上方的一对大旋钮，用于较大幅度地升降镜筒（或载物台），以调节物镜与标本之间的距离，确定合适的焦距。细调节螺旋是镜臂下方的一对小旋钮，用以微调焦距。

有些显微镜的调节螺旋是控制镜筒的升降，有的则是控制载物台的升降，所以使用时要特别注意旋钮转动的方向。

④倾斜关节：镜座和镜臂连接处的活动关节，可以调节显微镜的倾斜度，以便于观察。 但使用临时玻片时，禁止载物台倾斜，防止污染显微镜。 有些显微镜没有倾斜关节，不能调节倾斜度。

2.使用显微镜的操作

（1）显微镜的取用

显微镜平时存放在柜或箱中，取用时应一手紧握镜臂，一手托住镜座，使镜身直立。 不可单手倾斜提携，以防止目镜或反光镜摔落。

（2）显微镜的放置

应放在身体正前方略偏左距实验桌边缘10cm处，以防掉下。

（3）玻片的安装

将玻片放于载物台上，注意观察物应向上，用压夹卡紧玻片，用推动器移动玻片位置，使观察物正对于物镜的下方。

（4）镜头的使用

①低倍镜的使用：观察任何标本，首先一定要从低倍镜开始观察。 因为低倍镜的视野大，容易发现标本并找到需要观察的部位。 使用低倍镜时，在观察之前，先旋转粗调节螺旋，使物镜逐渐接近盖玻片，但应注意不能使其接触盖玻片。 然后用左眼注视目镜（右眼同时睁开），再旋转粗调节螺旋使物镜逐渐远离盖玻片，不久就可看见要观察的标本。 如果物像不够清晰，可旋转细调节螺旋至物像清晰为止。 通过推动器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物。

在任何时候使用粗调节螺旋聚焦物像时，必须先从侧面注视，小心向下调节物镜靠近标本。 然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行调焦，以免因一时的错误操作而损坏镜头及玻片。

②中、高倍镜的使用：需要用中、高倍镜观察标本时，也必须先用低倍镜找到观察标本，并把观察部位移到视野中央，然后转动镜头转换器，选用中、高倍镜，旋转细调节螺旋至物像清晰。 如果在转成中、高倍镜后，未见到物像，则需将物镜慢慢下降到几乎与盖玻片相接触的程度为止，然后旋转细调节螺旋，使物镜缓慢远离盖玻片，就可找到观察物。

③油镜的使用：把高倍镜下观察到的标本部位移到视野正中央，转动镜头转换器移去高倍镜，在标本的玻片上滴1滴香柏油或液体石蜡，转动镜头转换器，使油镜镜头浸没在油（石蜡）中。 观察时只需略微旋转细调节螺旋，即可看清物像。

用油镜观察完后，需将物镜移开，先用擦镜纸轻轻擦去镜头上的香柏油或液体石蜡，再用一块擦镜纸滴1滴二甲苯擦拭镜头，最后用干净的擦镜纸将镜头擦至清洁。（提示：在擦拭所有镜头时，只能用擦镜纸、绒布或绸布，不得使用其他物品或手指擦镜头。）

（5）光线亮度的调节

显微镜主要是利用自然光或灯光作为光源，光源的强弱直接影响聚光器和反光镜的使用。 当光源强时，聚光器向下降，并缩小虹彩光圈的口径，同时使用平面反光镜，以减弱光强；当光源弱时，聚光器向上升，开大虹彩光圈的口径，使用凹面反光镜，以增大光强。

在观察标本时，一般来说，使用低倍镜时，聚光器应下降，并缩小虹彩光圈，随着物镜放大倍数的增加，聚光器逐渐上升，并开大虹彩光圈。 使用油镜时，光的强度需调到比高倍镜时更强。

（6）显微镜的还放

用毕显微镜后，将物镜移开，把载物台上的玻片取掉，再将两个物镜以“八”字形同时搁在载物台上，用擦镜纸包住目镜，将显微镜放回柜或箱中。

（二）临时病原玻片的制作

在对病害症状识别和描述的基础上，需要对已产生的病征，或通过保温培养长出的病征以及分离培养物，根据病原菌的类型采用适当的制作方法进行处理，然后在显微镜下观察其形态特征。 常用的方法可以概括为：挑、撕、拨、压、切等。

1.挑片法

对于在基物表面生长茂密的霉状物，或个体分明的点状物，如子囊果、分生孢子器等，可以用尖细的挑针挑取少许置于载玻片上的浮载剂中，盖上盖玻片镜检观察。 在保证选材典型的前提下，所取材料越少越好，以免材料互相重叠，分辨不清。

2.撕片法

此法用于观察着生在寄主或基物表面的菌丝或孢子，寄生于表皮细胞内的真菌菌丝、吸器和休眠孢子囊，以及病毒病的内含体等。 先用刀片在寄主表皮上轻划一小口，再用尖镊子撕取一小块表皮组织，制片观察。

3.拨片法

对于产生在植物皮层下或半埋于基物内的病原物子实体，如分生孢子器、分生孢子盘、子囊果等，可以把病原物与寄主组织一同拨下，放入载玻片上的浮载剂中，用两支挑针，一支稳定材料，另一支小心拨去多余的植物组织，使病原物外露，然后盖上盖玻片在显微镜下观察。

4.压片法

此法适用于观察病原物子实体的内部结构，如子囊果、担子果、分生孢子器等。 将子实体浸在浮载剂中，加好盖玻片后用橡皮头轻轻挤压，将其中的内容物（子囊或孢子）压出，以便镜检观察。 也可在低倍镜下左眼观察，右手用针尖或尖镊子轻压盖玻片，至内容物被压出为止。 注意不要用力过猛，以免压破盖玻片。

5.徒手切片法

要观察患病植物组织病变、病菌入侵过程和在寄主体内的扩展，以及埋生于基物内的病原物子实体结构、植物组织内的细菌等，就需要将这些材料切成薄片观察。 徒手切片法是植物病理学研究的基本技术之一。

具体操作为：目测或用放大镜检视切片材料，用剪刀剪下成熟的材料（2~5mm），放入从中剖开的通草中，用左手拇指和食指夹住材料，右手持刀片由外向内平移，刀片与材料间约为45°，将通草连同材料切成薄片，抖落在白纸上或放入水中，再从中挑选1~2张带有病原结构的薄切片，放在载玻片上的浮载剂中，加盖玻片后镜检观察。

四、实验学时

2~4学时。

五、作业与思考题

1.制1张合格的临时病原玻片，镜检观察并绘图。

2.试说明对于不同的病征类型在进行显微镜观察时应采用何种制片方法。

附：常用浮载剂及封固剂

1.水

水是最常用的浮载剂，但易于干燥，仅适用于暂时性检查，不宜封固保存，且易形成气泡（检查材料以酒精、5%的明胶、水或稀肥皂水稍浸，洗净后再以水浮载可除去气泡）。

2.乳酚油

乳酚油不易干燥，标本可存放几天以上，为使标本易于辨别，常在其中加0.05%~0.1%的苯胺蓝（棉蓝）染色，也可加0.2%~0.5%的锥虫蓝等，因其是酸性染料，可染真菌原生质而不染细胞壁，故在观察、分隔难辨的真菌孢子等时可如此染色。 成分及配比如下：

3.甘油乳酸液

可加苯胺蓝等染料，其成分及配比如下：

4.水合氯醛碘液

碘与碘化钾研和，加水溶解，然后与水合氯醛混合。 此浮载剂能使真菌组织染上颜色，能弥补乳酚油的不足，看清细胞壁和其他结构。 但此法所制片只可保存几天，不宜久存。 若要久存，可除去碘液再用乳酚油浮载后封存。 成分及配比如下：

5.甘油

此浮载剂适于保存藻类、水霉菌等柔软标本。 将标本放在1滴10%的甘油中，加盖玻片，水分蒸发后，随时补加甘油至水分蒸发干净。 使用此法制成的标本玻片平放可经久不坏（擦去多余甘油，用香脂油或其他封固剂封固，可永久保存）。

6.甘油明胶

明胶在水中浸透，加热至35℃熔化，加甘油搅拌，用纱布过滤后使用。徒手切片及其他标本，都可用此剂浮载制片，标本染色（或不染）后，先用甘油脱水（干燥标本可不脱水）。 挑取小团甘油明胶放在载玻片上，微加热，待其熔化且气泡消失后，将标本取出吸去多余甘油后移入熔化的甘油明胶中，加盖玻片轻轻下压，擦去盖玻片周围多余的甘油明胶。 平放十几天，干后长期保存，用香脂或其他封固剂封固后可长久保存。 成分及配比如下：