一、目的要求
了解植物病原真菌分离及纯化的基本原理，掌握病原真菌的组织分离法，特别是表面消毒技术、无菌操作环节，熟悉稀释分离法、单孢分离法的原理及应用条件。
二、材料和用具
（一）实验材料
1.玉米小斑病或鸢尾褐斑病新鲜病叶。
2.培养基：清水琼脂培养基（WA）（三角瓶装，真菌分离用）；马铃薯葡萄糖培养基（PDA）（三角瓶装、试管斜面，真菌分离用）。
3.灭菌水（三角瓶装）。
4.药品：70%的酒精、95%的酒精、0.1%的升汞液或5%的次氯酸钠。
0.1%升汞液配制：升汞1g、浓盐酸2.5m L、蒸馏水1000m L。
（提示：先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。 升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心，实验完后要回收，不可乱倒。）
（二）实验用具
灭菌培养皿、试管、吸管、吸水纸、移植针、移植环、小刀、纱布、酒精灯、玻璃棒、铅笔、标签纸、棉花、电炉、镊子、铝锅等。
三、内容和方法
（一）实验原理
在受病组织的各个部位和其他基物中，病原真菌或细菌常常是和其他微生物混杂在一起的。 为了获得某微生物的纯菌株，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件的特殊要求，供给它适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂创造只利于此菌生长的条件，而抑制其他菌生长，从而得到该菌的纯菌株。 植物病害的鉴定，病原菌的特性、分类等研究，以及微生物在生产上的大规模利用，都必须经分离获得纯培养。
（二）组织分离法
1.准备工作
分离工作是在清洁无菌的环境下进行的，一般是在消毒的无菌操作室中，或超净工作台上进行。 在无上述条件设备时，在清洁且空气比较静止的房间内也可进行分离工作。 要求把工作台上的其他物品拿走，擦净工作台，放上一张湿纱布，地面洒上水，使其潮湿，工作所需一切物品都应放在工作台上，工作前用肥皂水洗手，再用酒精消毒。 分离时，避免在室内走动。
2.制作平板
将三角瓶内的清水琼脂培养基或马铃薯葡萄糖培养基熔化，倒10~15m L于灭菌培养皿中，轻轻摇动培养皿，使培养基在培养皿内分布均匀。 培养基冷却后，即成平板。
3.取材
将真菌叶斑病（如玉米小斑病）新鲜病叶用自来水冲洗掉表面的脏物（如泥土），选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块（每边长3~4mm）病组织数块。
4.淋湿组织表面或表皮毛
将病组织块放入70%的酒精中浸泡2~3s，消除寄主表面的气泡，淋湿组织表面或表皮毛。
5.表面消毒
把病组织块移入0.1%的升汞液中处理0.5~5min。
提示:升汞表面消毒的时间因材料而异,如柔嫩的植物组织,表面消毒时间宜短;反之则可长些。表面消毒的时间一定要控制好,太长会使升汞渗透到组织内杀死病原菌,太短则表面消毒不彻底。因此,可做一个时间梯度,即分别消毒0.5min、2min、3min、5min。除了用升汞表面消毒外,还可用其他表面消毒剂,如用5%的次氯酸钠进行3~5min表面消毒;70%的酒精亦可用于表面消毒,其处理的时间较短,一般为数秒至1min。
6.漂洗
用在酒精灯火焰上灭菌的镊子，将材料从升汞液中取出，放在装有灭菌水的培养皿中清洗，按顺序连续在3个培养皿中洗3次。
7.吸干多余的水分
用灭菌的镊子从第3个培养皿灭菌水中取出材料，放在装有数层灭菌吸水纸的培养皿中吸去附在材料上的水分。
8.摆放材料
用灭菌的镊子从吸水纸中取出材料，移入平板培养基（WA培养基或PDA培养基），每个培养皿内放3~5块材料，呈三角形或“梅花”形（如图9-1）。
图9-1 灭菌材料在平板培养基中的摆放方式
9.培养
材料放好后，贴上标签，将培养皿翻转，放在25℃恒温箱内培养3~4d。
10.纯化
待培养皿中的材料四周长出菌丝后，用移植针挑取边缘菌丝并连带菌丝下少量培养基，将其转移到斜面试管内再培养。如此转管2~3次，能够起到菌种纯化的作用。
11.保存
将获得的纯菌种置于-4℃冰箱中保存。
提示:(1)植物病原真菌分离可用WA培养基或PDA培养基,WA培养基无营养成分,污染菌不易生长,能获得较纯的病原菌。对一些生长较快的真菌如镰刀菌、链格孢菌等也常用WA培养基分离。PDA培养基有营养成分,易污染,但病原菌生长较快。对初学者来说,常采用WA培养基分离。
(2)若是对未知病原菌的组织进行分离,则要将长出的菌落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。对已知病原菌的组织进行分离,则根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否是目标菌,同时还需在显微镜下检查,进一步确定。
(3)组织分离工作中,如果植物材料较大且较软(如患灰霉病的番茄果实),在分离过程中,可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上,完成分离工作。
（三）稀释分离法
1.取灭菌培养皿3个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
2.用灭菌吸管吸取灭菌水，在每个培养皿中分别注入0.5~1.0m L。
3.用移植环蘸1滴孢子悬浮液，与第1个培养皿中的灭菌水混合，再从第1个培养皿移3环到第2个培养皿中，混合后再移3环到第3个培养皿中。
4.将熔化并冷却到45~50℃的培养基，分别倒在3个培养皿中（为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中先加入1~2滴25%的乳酸），摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
5.将培养皿翻转后置于恒温箱（25℃）中培养，数日后观察菌落生长情况。
6.将培养后长出的较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置于25℃左右环境中培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。
（四）注意事项
1.在倒平板时，为防止细菌的污染，可以在培养基中加入适当的乳酸或抗生素抑制细菌的生长。或在分离前1~2d倒平板，倒好平板后将平板置于28~30℃恒温箱内保存。分离时取出平板，剔除被细菌污染的平板。
2.注意分离工作要保证在无菌环境下操作，防止被空气中的杂菌污染。
3.在摆放材料之前用无菌吸水纸吸去患病组织处多余的水分，以大大降低患病组织附近出现细菌污染的可能性。
四、实验学时
3学时。
五、作业与思考题
1.每人交合格培养皿2个，并完成实验报告1份。
2.如果要分离的病原菌是卵菌中的腐霉菌、疫霉菌等，应当如何操作才会获得更好的效果？
3.为什么分离材料要取病健交界处，且不能切取过大或过小？
4.在分离、纯化步骤中，要避免污染应注意什么？
5.植物病原真菌、细菌分离有哪些相同和不同之处？
6.怎样判断你获得的病原真菌的菌种是否是纯培养？
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