植物病原真菌ITS的检测与鉴定

真菌的传统分类鉴定是以形态学为基础的，但真菌种类多，形态学特征又极为复杂，鉴定技术的掌握需要很强的专业背景，这给真菌的分类鉴定带来一定的难度。 随着分子生物学的迅速发展和真菌分类学自身发展的客观要求，在真菌现代分类中引入了操作简便、特异性好且准确可靠的分子生物学技术鉴定方法。

真菌的核糖体内转录间隔区位于rDNA片段上，包含两个不同的非编码区域，即ITS1和ITS2。ITS序列在物种属内、近缘属间及科内系统进化关系研究中有一定的价值。 真菌核糖体基因由小的亚单元（18S）、ITS1区、5.8S区、ITS2区和大的亚单元（28S）构成（图10-1），头尾串联形成重复序列，个基因组内有60~200个拷贝。真菌ITS区域长度一般为650~750bp。r DNA多复制的特性，有利于低浓度DNA样品中ITS区域的扩增。

图10-1 ITS区段PCR扩增引物示意图(仿Vilgalyslab)

在ITS应用中，设计和选用引物非常重要。 特异引物ITS1（5’-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）可用于大多数担子菌和子囊菌的检测，不过这些引物也能扩增一些植物ITS区域。ITS1-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS4-B（5’-CAGGAGACTTGTACGGTCCAG-3’）是真菌和担子菌的特异引物，能够显著提高特异性。 引物ITS1和ITS2（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）用于扩增18Sr DNA和5.8Sr DNA之间的ITS1区，引物ITS3（5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’）和ITS4用于扩增5.8Sr DNA和28S r DNA之间的ITS2区，其中引物ITS1和ITS4组合被大多数实验室所采用，用于扩增全部ITS区和5.8Sr DNA。

一、目的要求

了解利用ITS序列检测与鉴定植物病原真菌的原理，掌握PCR扩增真菌ITS的原理与基本操作技术。

二、材料和用具

（一）实验材料

植物病原真菌菌株。

（二）实验试剂

CTAB、Tris饱和酚、苯酚、氯仿、异丙醇、PCRBuffer、d NTP、Taq酶、真菌ITS特异性引物、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA染液、异戊醇、醋酸钠、无水乙醇等。

（三）仪器与用具

培养箱、超净工作台、电子天平、水浴锅、微波炉、PCR仪、移液器、各种规格的Eppendorf管、PCR管、冰台、电泳仪、电泳槽等。

三、内容和方法

（一）真菌基因组DNA的提取（SDS-CTAB法）

1.取适量菌丝，加入少量石英砂，加液氮，研磨成粉末。

2.加入2%的CTAB750μL，1/10体积的10%的SDS，1/100体积的β-巯基乙醇，65℃水浴1h,12000r/min离心5min。

3.吸取上清液，加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液，充分混合振荡，12000r/min离心5min，再吸取上清液。

4.加入等体积氯仿，充分混合，12000r/min离心10min，取上清液。

5.加入1/10体积的醋酸钠（3mol/L），再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀（过夜）。

6.12000r/min离心8min，倒去上清液，倒扣在吸水纸上。

7.加入1m L70%的乙醇（清洗，去盐），12000r/min离心8min,倒去上清液（2次）。

8.自然晾干（如管壁有液体，略微离心后用枪头小心吸出）。

9.根据DNA量加入去离子水（50~200μL），室温过夜溶解。

10.取3μL基因组DNA溶液电泳检测质量。

（二）真菌ITS片段的PCR扩增

1.PCR扩增体系

2.PCR扩增条件

94℃预变性5min；94℃变性15s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共34个循环；72℃延伸5min。

3.PCR产物电泳检测

取5μL反应产物，用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

（三）PCR扩增片段的回收

目的片段的纯化通过切胶回收实现。 切胶之前需要进行PCR产物的检测，确认目的片段的位置，以免在切胶时切错条带。

将30μLPCR产物和6×Lodaing Buffer的混合液（比例为5∶1）点入琼脂糖凝胶板中，电泳后，在凝胶成像系统下用刀片切取目的条带，放入2m L离心管中，用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。

（四）DNA片段的测序

将回收的片段送至生物公司测序。

（五）序列比对

将测序结果在Gen Bank（http://www.ncbi.nlm.gov）中进行Blast比对，序列分析后对病原菌进行分类鉴定。

四、实验学时

3~6学时。

五、作业与思考题

1.将实验过程及结果写成实验报告。

2.为了保证真菌基因组DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？

3.利用ITS序列鉴定真菌具有哪些优点和缺点？