传统细菌学检测与鉴定的主要依据是形态特征和生理性状，需要进行细菌培养及一系列复杂费时的生化反应或免疫学检测。 随着分子生物学技术的发展，细菌的检测鉴定从传统的形态特征、生理生化反应进入DNA鉴定水平，如G＋C含量、DNA杂交、r DNA指纹、质粒图谱、16Sr DNA序列分析等，其检测的准确性、灵敏性和快捷性都得到极大的提高。
细菌的16Sr DNA相对分子量适中，具有保守性和普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性好，因此现在普遍利用细菌的16S r DNA序列比对来对细菌的种属进行鉴定。
一、目的要求
了解通过16Sr DNA的检测与鉴定确定植物病原细菌种属的原理，掌握PCR扩增16Sr DNA的原理与基本操作技术。
二、材料和用具
（一）实验材料
植物病原细菌菌株。
（二）实验试剂
PCRBuffer、d NTP、Taq酶、细菌16Sr DNA特异性引物、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA染液等。
（三）实验仪器与用具
PCR仪、移液器、各种规格的Eppendorf管、冰台、电泳仪、电泳槽等。
三、内容和方法
（一）细菌基因组DNA的提取
1.挑单菌落接种到10m LLB培养液中，于37℃振荡培养过夜。
2.取2m L菌悬液到2m LEppendorf管中，8000r/min离心2min，取上清液。
3.加140μLTE打散细菌，再加60μL10mg/m L的溶菌酶，37℃放置10min。
4.加400μLDigestion Buffer，混匀，再加3μLProtein K，混匀，55℃放置5min。
5.加260μL无水乙醇，混匀，转入UNIQ-10吸附柱中，10000r/min离心1min，取上清液。
6.加500μL70%的乙醇，10000r/min离心30s，取上清液。
7.重复1次步骤6。
8.10000r/min离心2min，彻底甩干乙醇，吸附柱置于新的1.5m L Eppendorf管上。
9.加50μL60℃预热的洗脱缓冲液，室温放置3min，12000r/min离心2min，即得细菌基因组DNA。
10.取3μL基因组DNA溶液电泳检测质量。
（二）16Sr DNA的PCR扩增
1.细菌16Sr DNAPCR扩增的引物
16S-F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
16S-R5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
2.PCR扩增体系
3.PCR扩增条件
94℃预变性3min;94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸100s，35个循环；72℃延伸7min。
4.PCR产物电泳检测
取5μL反应产物，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。
（三）PCR扩增片段的回收
凝胶电泳结果若为1条带，可直接回收产物。 否则需从琼脂糖凝胶中切割目的条带，并回收目的片段。
1.称量2m LEppendorf管质量，记录。
2.在紫外灯下切割含目标条带的凝胶，放入2m LEppendorf管，称量，计算凝胶质量。
3.每100mg凝胶加入100μL Binding Buffer，混匀，60℃温育至凝胶熔化。
4.转入UNIQ-10吸附柱中，10000r/min离心1min，取收集管中液体。
5.加500μLBinding Buffer，10000r/min离心1min，取收集管中液体。
6.加500μL70%的乙醇，10000r/min离心30s，取收集管中液体。
7.10000r/min离心2min，彻底甩干乙醇，吸附柱置于新的1.5m L Eppendorf管上。
8.加30μL60℃预热的洗脱缓冲液，室温放置3min，12000r/min离心2min，即得回收的DNA片段。
（四）DNA片段的测序
将回收的片段送至生物公司测序。
（五）序列比对
将所测16Sr DNA序列与NCBI数据库序列进行比对和同源性分析，确定待测菌株的分类地位。
四、实验学时
3~6学时。
五、作业与思考题
1.将实验过程及结果写成实验报告。
2.为了保证细菌基因组DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么？
3.利用16Sr DNA序列鉴定细菌具有哪些优点和缺点？
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