植物病原菌孢子萌发的测定与应用

一、目的要求

掌握血球计数板的使用方法，学习孢子萌发率的测定方法，特别是萌发条件和判断标准。 开展植物病原菌孢子萌发的抑制实验，进行生防菌和化学药剂的筛选评价。

二、材料和用具

（一）实验材料

烟草赤星病菌（Alternaria alternata）或灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

（二）实验用品

0.5%的葡萄糖、血球计数板、培养皿、灭菌水、移液枪、显微镜、接种环、玻璃棒、凹玻片、试管、拮抗细菌、菌核净（或代森锰锌）、苯胺蓝等。

三、内容和方法

（一）孢子萌发率的测定

1.配制孢子悬浮液

将培养好的病原真菌孢子用灭菌水从培养基上洗脱下来。

2.测定孢子浓度

用血球计数板数孢子数，并将配制的孢子悬浮液稀释到1×105~1×107个/m L，最后加入0.5%的葡萄糖溶液50m L，置于常温下。

3.测定孢子萌发量

每隔一段时间用计数器测定一次孢子的萌发数，并计算孢子萌发率。

（二）拮抗菌对孢子萌发的抑制

1.拮抗菌发酵液的处理

将斜面上培养基培养48h的拮抗细菌移于LB液体培养基中，28℃， 500r/min恒温摇床振荡培养48h后，用纯水稀释200倍、400倍备用。

2.孢子抑制率的测定

将烟草赤星病菌接种在PDA固体平板上，26℃培养，产孢后，取成熟孢子，用灭菌水稀释至1×106个/m L。将等体积的拮抗菌菌株发酵液与孢子悬浮液充分混合后，将配制好的孢子液滴加于凹玻片上，每个处理重复3次；设用清水混匀的孢子悬浮液为对照。26℃恒温条件下放置，湿度90%。12h后，用苯胺蓝染色固定，镜检烟草赤星病菌分生孢子萌发的情况，与对照比较各处理对孢子萌发的抑制率。

抑制率（%）=[（对照孢子萌发数-处理孢子萌发数）/对照孢子萌发数]×100%

（三）化学药剂对孢子萌发的抑制

1.配制药剂

按所需药剂的浓度计算称取药剂，并将药剂溶解于灭菌水中，充分溶解，得到所需的药剂溶液。

2.制备孢子悬浮液

在平板上培养病菌，产生成熟的孢子之后，用灭菌水洗脱平板上的孢子制成悬浮液并镜检,使孢子浓度达到1×106个/m L。

3.孢子萌发测定

取0.5m L孢子悬浮液和0.5m L药剂溶液，将其加入凹玻片的凹槽中，充分混匀。每隔4h测定一次孢子的萌发数。

（四）注意事项

1.向血球计数板加孢子悬浮液时，要避免产生气泡，否则会影响计数结果。

2.在凹玻片中混合时，一定要保证混合均匀，避免影响测定结果。

3.每个实验组都要做清水对照和重复组，避免实验过程的偶然误差。

四、实验学时

6学时。

五、作业与思考题

1.制作孢子萌发率曲线，计算1~2种拮抗菌和1~2种化学药剂的抑制效果，并完成实验报告1份。

2.烟草赤星病菌孢子萌发的标准是什么？

3.通过显微观测绘制的孢子萌发曲线有何用途？

4.除了采用孢子萌发抑制法筛选生防菌或化学药剂外，还有哪些筛选方法？