种子带菌常成为病害发生的重要初染源和病害远距离传播的主要途径。因此，种子检验是病害防治和病害研究的重要手段，其主要作用有：（1）用于植物检疫；（2）用于种子质量检验，能判断其是否符合良种的标准、决定其能否调运及种植；（3）了解种子带菌种类、带菌量及病菌潜伏部位，并依据此结果选择种子处理方法及药剂；（4）用于病害发生与侵染循环的研究。常用的种子检验方法有：直接检验、过筛检验、洗涤检验、分离检验、解剖检验、萌芽检验及隔离栽培检验。 此外，还可用噬菌体检验、血清学反应检验、电镜检验、荧光检验、化学检验、分子生物学检验等。 总之，检验要根据不同的材料，选用简单易行、快速准确的方法，有时还需要用几种不同的方法检验，才能做出决定。
同时，种子带菌也是当地病害扩展蔓延的重要途径。 进行种子消毒处理，消灭种子所带病原菌，是切断远程传病、防止病害迅速扩大蔓延的重要方法，是病害防治的一种重要措施。 并且种子体积小，又比较集中，易于人为管理。 当然，任何种子处理方法都应以不损害种子发芽率为前提条件。 因此，种子处理不仅要注意对种子本身的影响，还要观察杀菌效果、考虑农药的毒性和残留。
一、目的要求
通过实验，掌握最常用的种子检验方法，即洗涤检验、分离培养检验和保湿培养检验，了解种子带菌的主要病原菌种类。 并在此基础上通过具体操作掌握常用的种子处理方法，明确种子处理的作用和效果，比较各种处理方法和药剂的优劣。
二、材料和用具
（一）实验材料
带菌稻种、棉种。
（二）实验用具
显微镜，手柄放大镜，离心机，天平，三角瓶，挑针，镊子，酒精灯，滴管，灭菌吸水纸，纱布，载玻片，盖玻片，灭菌水和乳酚油滴瓶，培养基（WA、PDA），灭菌水，0.1%的肥皂水，0.1%的升汞溶液，酒精（30%和70%），量筒（100m L），接物测微尺，接目测微尺，纽罢尔血球计数器，生石灰，杀菌剂（PCNB、拌种双、拌种灵和多菌灵），药匙，烧杯，电炉，电热恒温水浴锅，花钵，瓷盘，玻璃棒，标签，灭菌培养皿，来苏尔等。
三、内容和方法
（一）种子检验
1.用洗涤法检验稻种外表附着的真菌种类和孢子负荷量
（1）取稻种100粒放入三角瓶中，注入灭菌水20m L，加0.1%的肥皂水几滴，强烈摇动洗刷（手摇40次以上）。
（2）将洗涤液注入2个离心管中，每管1/2，用粗天平平衡，1000r/min离心5min。
（3）取出离心管，倒去上清液，保留底部沉淀物，每管再加入0.5m L灭菌水。
（4）用滴管将沉淀物搅拌均匀后，每管各取1滴制片，在显微镜下观察（放大倍数约300倍）。
镜检时，先找病原菌种类，并将病原菌名称及其简图填入表23-1。
表23-1 稻种表面带菌种类
2.测定稻种稻瘟病菌或稻粒黑粉病菌孢子负荷量
（1）血球计测定法
纽罢尔血球计数器是一种玻璃片，其上有若干小方格，每一小方格的面积为00.5mm×0.05mm，深度为0.1mm，因此每个小方格的体积为0.00025mm3。 操作时是将血球计数器的吸管与玻璃片充分洗净并干燥，用吸管吸取离心后的沉淀悬浮液注入计数器内（注意液体不能溢出，盖片下也不可有气泡），然后在显微镜下检查，通常是观察80个小方格。记录每一小方格内的孢子数，并算出每一小方格的孢子平均数。以小方格内孢子平均数乘以“4×106”，即得出1m L所含有的孢子数。由此即可求出每粒稻种表面的平均孢子负荷量。
（2）显微镜计测法
即先在显微镜下确定每一视野的平均孢子数，再通过一系列的计算方法确定一粒稻种表面的孢子负荷量，具体步骤如下。
①测定视野半径
将接物测微尺安放在载物台上，测定一个视野的直径，重复3次，求出视野半径R的平均值。
②计算显微镜视野中的孢子数
用滴管将制成的孢子沉淀液搅拌均匀后，每滴管各取1滴分别制片，每一玻片棋盘式检查10个视野，重复3次，算出每一视野的孢子平均数A。
③测定1m L水的滴数
用前面所用滴管多次吸取50m L水并一滴一滴地滴下，统计50m L水的滴数，重复3次，求出1m L水的平均滴数M。
④以下列公式计算稻种表面平均孢子负荷量
X=A×K÷洗涤稻种粒数
X：每粒稻种表面平均孢子负荷量
A：每一视野的孢子平均数
K：固定系数K=H×M÷πR2
H：盖玻片的面积（一般为18mm×18mm或20mm×20mm）
M：1m L水的滴数
R：视野半径
3.用分离培养法检验稻种内部的病原菌
（1）将WA熔化后倒入灭菌培养皿（每皿10m L）备用。
（2）依次将70%的酒精（1皿）、0.1%的升汞液（1皿）、灭菌水（3皿）倒入灭菌培养皿中，贴上标签。
（3）取10粒稻种放入70%的酒精中湿润数秒，以除去稻种表面的气泡，然后放入0.1%的升汞液中消毒60s，再用灭菌水清洗3次，放于灭菌吸水纸上吸干表面水分。
（4）将稻种置于WA平板上，每皿5粒，7d后镜检。
（5）鉴定：挑取各粒稻种表面长出的各病原菌，制片镜检，记录每粒稻种表面长出的病原菌种类。
4.用保湿培养法检验稻种上稻瘟病的带菌率
取1套灭菌培养皿，将4层灭菌吸水纸放入皿底，倒入灭菌水使吸水纸充分湿润后放入2根曲玻棒。随机取稻种100粒，清水冲洗后放于灭菌载玻片上，每片50粒，整齐排列成2行，使护颖一端向外，并将载玻片平放于曲玻棒上， 25℃恒温保湿培养2~3d，逐粒镜检护颖部，记录稻种上稻瘟病的带菌率。
（二）种子处理
1.稻种浸种（石灰水浸种）
恰当的浸种方法不仅能消灭种子内外的病原菌，而且有提高产量的趋势。 石灰水浸种对防治水稻稻瘟病、胡麻叶斑病、恶苗病和小麦散黑穗病、腥黑穗病、秆黑粉病等都有很好的效果。 同时，用石灰水浸种，取材容易，操作简单，对人畜无毒害，对种子生理亦无毒害。 因此石灰水浸种是较常用的一种种子消毒方法。
石灰水浸种杀菌并不是利用石灰本身的杀菌作用。 因为清水浸种被证明同样具有一定的杀菌效果。 水中加入生石灰的目的在于防腐。 石灰水杀菌作用的原理被认为有两种：其一是种子处于水中无氧状态下，其呼吸作用会产生酒精和醛类物质，这些物质可以杀菌，是“生理杀菌”作用；其二是种子处于水中，其周围所沾染的某些嫌气性细菌由于发酵产生大量对病原菌有害的蚁酸和琥珀酸等渗入种子内部，是“有机酸发酵杀菌”作用。 相关实验证明这两种作用确实存在。
（1）操作方法
将500g生石灰用少量水化开，再加50kg水，配成1%的石灰水，浸没种子后水面高出10~20mm，以免种子发芽（50kg石灰水可浸种30kg）。先要充分搅动，并加盖，此后不再搅动直至达到浸种时间。 然后捞出晾干播种。
提示:浸种时间的长短要因气温高低而定,一般35℃时需1d,30℃时需1~2d,25℃时需2d,20℃时需3d,15℃时需6d。
（2）注意事项
①要求是新鲜的生石灰；②水要求清洁，以减少腐败因素；③调制石灰水时必须先用少量清水将石灰化开，再按约1∶100的比例加入清水，否则生石灰块不能在水中溶解；④浸种种子不宜过多，如果水中种子层集过厚，种子有发热并丧失发芽能力的危险，因此一般以不超过0.6m为度；⑤种子必须浸入水中10~20mm并一直保持此水层，否则有发芽的危险；⑥浸种应避免阳光直射，防止水温升高影响浸种时间；⑦浸种时间内严禁搅动；⑧浸种最好在晴天进行，晴天气温高，浸种时间短，浸后种子也易干燥，浸种后如遇阴雨，种子不易干燥，可用草木灰拌种，并摊晾于通风处，避免种子发芽和霉烂；⑨受伤、发育不良、发芽力弱的种子不能用石灰水浸种；⑩预先用硫酸铵等汰选过的种子，必须经过清水漂洗后才能用石灰水浸种，经过石灰水处理的种子如果要再用矮壮素（CCC）处理，矮壮素处理前也必须要充分干燥。
（3）浸种效果检查
①检查处理后的种子发芽势及发芽率
取经过处理和未处理的种子各100粒，分别放于充分保湿的培养皿内（每皿50粒，各皿条件一致），置于25~30℃温箱中发芽，记录开始发芽的日期和每日发芽数，最后计算发芽势和发芽率。
②检查种子处理的灭菌效果
取经过处理和未处理的种子各15粒，无菌操作放置于WA平板上（每皿5粒），25℃培养5d后镜检，记录病原菌的种类和出现频率。
2.棉种温汤浸种和拌种
（1）种子接菌
用人工培养的炭疽菌制成孢子悬浮液并浸棉种12h，然后取出棉种晾干备用。
（2）土壤接菌
将用麦粒沙培养的立枯病菌的固体菌以1∶100的比例与土壤混匀，装入花钵中，插上标签备用。
（3）温汤浸种
①将接菌的棉种在冷水中预浸24h；②将种子放入65~70℃的温水中，种子与水的比例为1∶4，并在55~60℃下恒温保持30min；③取出晾至绒毛发白，备用。
（4）药剂拌种、盖种
将拌种双（或拌种灵、多菌灵）与细沙或过筛草木灰混匀，拌上已处理的棉种，拌成羊粪状，并可用药土盖种（与种子混合播种亦可），每窝盖药土100~150g。
（5）处理效果检查
取经过处理的棉种100粒，分别播种于接菌土壤，同时以未接菌的土壤为空白对照，以0.5%PCNB处理的土壤作参考对照。棉种播种后按一般栽培方法进行管理，并注意观察和记录种子发芽情况与发病情况。
①种子发芽情况观察记录
参照稻种浸种处理的种子发芽率和发芽势检查方法进行。
②发病情况观察
棉苗长出第一片真叶后，将其拔起并用水清洗干净，检查炭疽病、立枯病等的发病情况（必要时进行分离培养观察）。将以上结果记录于表23-2。
表23-2 棉种处理效果记录
五、作业与思考题
6~8学时。
四、实验学时
1.记录并计算种子检验结果，对检验结果做简要的分析，并提出种子处理的意见。
2.写一份种子处理的试验报告，内容包括处理方法、处理效果，比较各处理方法的优劣，并分析其原因。
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