一、目的要求
学习显微计测和显微描绘的一般方法。 要求掌握接目测微尺的标定方法，测量出1~2种病菌孢子大小，学会在显微镜上安装和使用显微描绘仪并描绘出1~2个病菌孢子。
二、材料和用具
（一）实验材料
玉米小斑病菌（Bipoloris maydis）、烟草赤星病菌（Alternaria alternata）孢子悬浮液，以及其他病原菌材料。
（二）实验用具
接目测微尺、镜台测微尺、血球计数板、显微描绘仪、培养皿、吸管等。
三、内容和方法
（一）显微计测
显微计测就是在显微镜下测定病原物形态的大小，并用加权平均数和大小幅度来表示。 常用的是接目测微尺计测法。 接目测微尺（简称“目尺”），是一片可以装入目镜的圆形玻片，其上有1把小尺（50格），每1格所代表的长度因显微镜放大倍数不同而异。 因此需用镜台测微尺校准，以求出在该显微镜一定放大倍数的目镜和物镜下目尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺（简称“台尺”）是一片大小形状和载玻片相似的特制玻片，中央有一个圆圈，正中央刻有1把尺，长1mm，均分为10大格，100小格，每小格为0.01mm（即10μm）。
1.接目测微尺的校准
（1）安装目尺
取出目镜，把目镜上的透镜旋下，将用擦镜纸擦干净的目尺刻度面朝下放在目镜镜筒内的隔板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
（2）校准目尺
将台尺刻度面朝上放置于显微镜载物台上。 先用低倍镜观察，将台尺有刻度的部分移到视野中央，调节焦距。 在能清晰地看到台尺的刻度后，转动目镜使目尺与台尺的刻度平行。 利用推动器移动台尺，使目尺和台尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间台尺和目尺所占的格数。如此重复3次，如下表。
表4-1 显微镜目尺校准结果示例
台尺：6格＋12格＋30格＝48格
目尺：13格＋25格＋64格＝102格
在此目镜和物镜放大倍数下，目尺每格代表的长度（L）算法如下：
用同样的方法换成中、高倍镜和油镜进行校准，分别测出在中、高倍镜和油镜下目尺每格所代表的长度。
观察时光线不宜过强，否则难以找到台尺的刻度；换到高倍镜和油镜进行校准时，务必十分小心，防止物镜压坏台尺和损坏镜头；目尺换用在其他显微镜上或镜头和镜筒的长度有所改变时，必须重新校准。
2.病原菌形态大小的测定
将病原菌制成临时玻片，安放在载物台上，在低倍镜下测定病原菌（如孢子）的长宽所占目尺的格数并记录。 随机选取30个孢子，测定其长宽并记录。 最后算出该放大倍数下所测孢子的大小幅度和加权平均数。
孢子大小表示方法：最短~最长（长度平均值）μm×最窄~最宽（宽度平均值）μm
如：12.1~22.4（18.4）μm×3.5~5.0（4.6）μm
制片时最好用清水作浮载剂，而不用乳酚油；以成熟的病原菌为准而不测未成熟的；菌丝体一般测量基部直径，孢子测量长宽，子囊果、分生孢子器测量纵横直径，均以最长、最宽处为准。
3.真菌孢子或细菌数量的测量
测定液体中孢子浓度的方法很多。 除了菌落计数和比浊法外，常用的是用血球计数板来测量孢子的数量。
（1）血球计数板是1块特制的加厚载玻片，中部有2条纵槽，1条横槽，组成“H”形，在上下两个方框中刻有高度精确而纤细的刻线，加放盖玻片后，上下两方框离盖玻片的距离为0.1mm。 在每个方框中有9个边长各为1mm的大格，中间1个大格的部位（血球计数室）适合测孢子的数量，这个大格的边长为1mm，面积为1mm2。这个大格又分成25个中格，每个中格都用双线分开，中格边长为0.2mm，面积为0.04mm2。每个中格又分成16个小格，每个小格边长为0.05mm，面积为0.0025mm2，即1／400mm2，所以每个大格的体积为0.1mm3,每个中格的体积为0.004mm3,每个小格的体积为1/4000mm3。
每毫升孢子数量＝每小格平均孢子数×4000×1000＝每个小格有菌数×4000000
（2）菌液孢子浓度的测定：首先将培养的菌液摇匀后用滴管滴在中央平台上，盖上盖玻片。 如果菌液浓度过大，则要先稀释，再将稀释的菌液用来镜检、计数。 通常检查5个中格内的孢子数，5个中格分别在4个角上和中央，共计80个小方格。计数的方格多且分布在不同方位上，可以避免孢子在各方位上分布不均所造成的误差。
每毫升测量的菌液中孢子浓度=80个小格中孢子总数×4000000÷80=80个小格中孢子总数×50000
（二）显微描绘
1.使用方法
在显微镜检时，可以徒手描绘，但是较准确的是用显微描绘仪。 显微描绘仪的种类很多，它们都是利用棱镜折光的原理，操作的关键是调节光线。当显微镜中病菌上的光亮度与绘图纸上笔尖的光亮度相接近时，就能按实物的形状描绘。 在使用时应注意如下事项：
（1）反光镜位置的角度应为45°。
（2）在未画完之前切勿移动描绘仪和绘图纸。
（3）描绘用的铅笔笔头要削尖。
（4）调节显微镜光的强度，使所描绘的物体与笔尖都能同时被看得很清楚。
（5）先用描绘仪绘出草图，然后再做精细的修整。
每个同学在显微描绘仪下描绘玉米小斑病菌分生孢子，先作草图，然后修整。
2.使用技巧与注意事项
（1）布点
布点是一项细致而费工的技巧。 点要点得圆，点得匀，点子的排列，要保持整齐、均匀，均匀中求变化，变化中要统一。 所以应有计划（心中有数）地从明处点起，小心而慢慢地点，一行行交互着点，不要等到画好看着太疏而再加点子，再加的点子反而会变得不均匀。 明的部分、色淡的部分点子小些、稀些，暗的部分、色深的部分点子要大些、密些。
（2）划线
划线是绘图的又一基本功，一般以肘贴桌面，掌侧和小指抵图纸，紧握笔杆，从左下向右上的方向运笔，同时应闭气用力，使线条均匀、光滑、流畅，一般来说，不应露出笔尖起落的痕迹。 笔尖含墨的多少，压笔力的大小，常引起线点的粗细变化，要多加体会运用。
（3）注意事项
绘图时必须安静有耐心，特别是换用绘图仪描绘时，座位的高低必须合适，以免容易疲劳。 草图应一气绘成，不要中途停顿。
四、实习时间
1天。
五、作业与思考题
1.校准目尺，将数据填入下表。
表4-2 显微镜目尺校准结果
2.测量病原菌分生孢子的大小，写出报告，并显微绘图。
3.进行显微描绘时，时常发生看不清病菌或看不清铅笔尖的情况，应该怎么办才能使病菌、纸和笔尖都看得清楚？
4.病原物形态图的绘制，一般经过哪几个步骤？如何很好地完成这些绘图步骤？每一步应注意哪些问题？
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