柯赫氏法则是植物病理学遵循的一项基本原理，它能够证明引起某一病害的病原物，进而开展病原物特性的研究以及寄主植物-病原物的互作关系探究等。
一、目的要求
学习柯赫氏法则的内容，掌握基本的病原物分离和接种的方法，明确引起某一病害的病原物的判断标准。
二、材料和用具
（一）实验材料
健康大豆幼苗（培育4d后）、大豆疫病（Phytophthora sojae）病样、健康马铃薯薯块、马铃薯晚疫病（P.in festans）病样。
（二）实验用具（药品）
灭菌培养皿、玻璃棒、接种针、酒精灯、5%的Na Cl O消毒液、75%的酒精、剪刀、手术刀、镊子、灭菌滤纸、移液枪、接种针、V8培养基、利福平、超净工作台等。
三、内容和方法
（一）病原菌的分离、纯化
在病组织的各个部位和其他基物中，病原细菌常常是和其他微生物混杂在一起的。 为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件的不同要求，供给它适宜的生活条件，即让病原细菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂创造只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。 为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，病原菌的分离中最常用到的是组织分离法，操作简单方便。
1.准备工作
工作台灭菌，准备6个灭菌培养皿，其中1个加入75%的酒精，1个加入5%的Na Cl O消毒液，3个加灭菌水，1个加灭菌滤纸。
2.取材
选取发病症状比较典型、新鲜较嫩的病组织，用75%的酒精将组织表面先消毒，待组织表面干燥后用剪刀或手术刀切取大豆粒大小的病健交界处组织。
3.消毒
将取好的组织放置于事先准备好的5%的Na Cl O消毒液中，消毒1~2min。
4.漂洗
将消好毒的植物组织放到灭菌水中，漂洗30~50s，依次漂洗3次。
5.干燥
灭好菌的植物组织放置于事先准备好的滤纸上，过一会儿可以翻转一下，使其快速干燥。
6.培养
将干燥后的植物组织放置于平板培养基上，25℃恒温培养。
7.纯化
待培养基上植物组织块周围长出菌丝时，将其接种到新的培养基上，再次培养，直到得到纯的病原物培养物时保存菌种。
（二）病原菌的接种、发病和再分离
取数皿之前分离所得的病原菌，切成小菌丝块后，加入V8培养基中液体培养48h，再换水3次。 换水18h后吸取液体（含有大量游动孢子的菌悬液），将菌悬液用移液枪滴到大豆幼苗上，并在恒温条件下（25℃）保湿1d。接下来每天观察发病情况，并做好记录。 从发病大豆幼苗的病健交界处分离病原菌，与最初获得的分离物进行对比。
（三）柯赫氏法则的内容
1.在患病植物上常伴随有一种病原微生物存在。
2.该微生物可在离体条件或人工培养基上分离纯化而得到纯培养。
3.将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害。
4.从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性状与接种物相同。
（四）注意事项
1.病原物分离过程中，灭菌时间不能太久，避免病原菌被杀死，无法分离到所需病原菌；灭菌时间也不能太短，避免有太多杂菌，不利于病原菌的纯化。
2.病原菌接种时，菌悬液浓度不能太高或太低，喷洒的菌悬液不宜太多，看到叶片上有一层薄雾，但水滴不会掉下即可。
3.病原菌的纯化中，要及时地转接到新的平板，这样更有利于分离到较纯的培养物。
四、实习时间
2天。
五、作业与思考题
1.每人书写实验报告1份，详细记述实验过程及观测结果。
2.如何判断所获得的分离物是否为纯培养物？
3.在柯赫氏法则证病实验中，运用到了哪些植物病理学实验技术？ 试举例说明。
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