原生质体培养_关于刘大钧的故事

原生质体培养_关于刘大钧的故事

一般认为，去除了细胞壁的植物体细胞在作物的改良中有着重要的意义，它是外源遗传物质的良好受体，能够吸附或摄入外源的细胞器、脂质体、质粒、分子片段等。从这种细胞的原生质体再生完整植株是其高效应用于遗传工程的关键（注：刘大钧：《向小麦转移外源抗病性回顾与展望》。《南京农业大学学报》，1994年，第17期，第1—7页。）。刘大钧看准这一点，先后派出吴琴生和杨世湖两位优秀学生和得力助手去英、美学习小麦、水稻原生质体培养与利用的技术，派到当时国际上公认最有水平实验室，因此，刘大钧带领的科研团队在原生质体的培养上亦很快走在国际先进水平的前列。据陈佩度回忆，“吴琴生在英国洛桑试验站搞小麦的原生质体培养，他是在国际上最早拿到了绿芽的。杨世湖是最早拿到籼稻原生质体成苗的，可以说他们做出来的都是国际一流水平。”在问到吴琴生教授时，他谦虚地说到：“这都是得益于刘先生的英明决策啊，当时学校的第一个863项目就是在刘先生的带领下做小麦的原生质体培养和细胞融合，也就是那时候为后来打下了基础。”

1986年3月，面对世界高技术蓬勃发展、国际竞争日趋激烈的严峻挑战，王大珩、王淦昌、杨嘉墀和陈芳允4位科学家提出“关于跟踪研究外国战略性高技术发展的建议”。在这份报告中，他们针对世界高科技迅速发展的紧迫现实，向中共中央提出了建议和设想：要全面追踪世界高技术的发展，制定中国高科技的发展计划。这份报告很快得到邓小平的批示，他认为这个建议十分重要，并指示“找些专家和有关负责同志讨论，提出意见，以凭决策”，并认为“此事宜速作决断，不可拖延”。在充分论证的基础上，党中央、国务院果断决策，于1986年11月正式启动实施了高技术研究发展计划，简称“863计划”，旨在提高中国自主创新能力，坚持战略性、前沿性和前瞻性，以前沿技术研究发展为重点，统筹部署高技术的集成应用和产业化示范，充分发挥高技术引领未来发展的先导作用。

图7-4　1986年刘大钧（左二）访问英国洛桑试验站，看望吴琴生（左一）、翟虎渠（右一）

此时，作为国内植物细胞遗传学领头人的刘大钧，敏锐地感到了国家对高新科研的重视。恰逢吴琴生在英国访学，对西方的高新技术有一定的了解，当即决定要拿下“863”项目。吴琴生按计划是1987年7月回国，刘大钧再三嘱托一定要按时回来，因为项目申报听证会就在8月。酷热的首都，和往常一样到处散发着热气，刘大钧和吴琴生在北京会合了。经过商讨，刘大钧决定以吴琴生的名义申报这个项目，因为自己毕竟身为校长，对分子遗传方面的前沿知识也没有吴琴生了解。吴琴生一开始很不情愿，觉得自己不能抢在老师前头，但这也是刘大钧过人的地方，该退居二线时绝不“奋勇争先”。在刘大钧的支持和鼓励下，吴琴生申请了“小麦原生质体培养、细胞融合和植株再生”项目。这样的组合——先进的生物技术加上雄厚的科研实验条件，征服了各位评审的专家，吴琴生、刘大钧很顺利地拿下了这个项目。数十万元的科研经费，让吴琴生这个刚刚学成回国的海归，一下有了可以学以致用的地方。

据吴教授讲，1985年的时候，刘大钧把他送到英国洛桑试验站去作访问学者，学习生物技术。当时送到英国，也是经过刘大钧深思熟虑的。当时很多人都去美国，但是刘大钧觉得英国的生物技术在世界上也是领先的，既然大家都去美国学习，那就学不到独特的先进技术了，所以就把他派到了英国。在此之前，刘大钧还让吴琴生随学校农业考察团，去了一趟澳大利亚，对澳大利亚的生物技术研究进展也有所了解（注：吴琴生访谈，2013年5月17日，南京。资料存于采集工程数据库。）。吴琴生教授去英国访学3年，带回了英国最先进的生物技术。随之，刘大钧的分子遗传研究室生物技术研究力量得到进一步加强。(www.guayunfan.com)对多花黑麦草的研究

20世纪80年代以来，禾谷类植物的原生质体培养和植株再生研究发展很快。自Vasil（1980年）首先从珍珠栗原生质体培养获得小植株后，各路研究人员又从羊草、象草和甘蔗原生质体培养出再生苗，粳稻、棒头草、玉米和普通小麦等原生质体培养亦相继再生成苗。刘大钧在与陈佩度、吴琴生等人商量后，将研究目标转向多花黑麦草（Annual Ryegrass，学名：Lolium multifolorum）。多花黑麦草是重要的禾本科牧草，具有蛋白质含量高，抗禾谷类多种病害等特点，在我国华中、华东、华南地区均有分布，研究多花黑麦草的原生质体的分离培养和再生植株对禾谷类作物和牧草的基因工程及细胞融合研究都有重要意义。原生质体培养的研究，不仅是生命活动理论研究一个良好的载体，对改良作物的某些性状，潜力巨大。

1989年，在团队的共同努力下，通过多花黑麦草幼穗培养获得5个品种的细胞悬浮培养系，其中1个培养系颗粒较粗，具有分化能力，但是原生质体得率很低，另外3个品种的细胞系虽然细胞团非常细小，生长速度也很快，但分化能力很低，只有品种Multimo产生的细胞系不但含有很细小的细胞团而且有结构致密、体积较大的细胞团，这个细胞系既具有分化能力，原生质体得率又达到实验要求。在刘大钧、吴琴生指导下，陈文品等人通过研究还发现，原生质体培养的结果除了与培养基、培养方法和原生质体密度有关外，还与用作游离原生质体的悬浮细胞的生长状态有关。每次继代培养时的接种量和继代培养间隔时间（3~6天）是悬浮细胞保持良好生长状态的重要因素。刘大钧、吴琴生、陈文品等通过实验比较了3种不同的原生质体培养方法，发现用看护培养植板率最高，用琼脂糖固体平板培养方法比较简单，也可以获得比液体浅层培养高的植板率。这个结果和陈东方、夏振傲（1987年）在榜头草原生质体培养中的结果是一致的。关于原生质体培养基中的氮素营养，他们得到的结论是：将MS培养基中的氨和硝酸盐全部去掉，只用谷氨酰胺作为氮源可以取得较好的结果。同时实验结果也表明，用有机态氮代替氨态氮和硝态氮能得到较高的原生质体植板率，在多花黑麦草培养基中加入葡萄糖可以有效地提高原生质体植板率，这与在粳稻、榜头草、普通小麦中的实验结果相似。1982年，Joneg和Dale将多花黑麦草原生质体培养成愈伤组织。1988年，Dalton从原生质体再生的愈伤组织上分化出绿苗和白苗。刘大钧团队的实验也在1990年从多花黑麦草原生质体培养分化出白苗。禾本科植物在花药培养中出现白化苗是一个普通现象，在原生质体培养中出现白化苗也屡有报道。多花黑麦草在体细胞培养时就易出现白化苗，并且随着继代培养次数的增加白苗频率随之增高。因此，刘大钧团队认为白化苗现象可能会成为多花黑麦草原生质体培养成植株的主要障碍，对于其发生的原因及控制办法，有待作进一步探讨。

创新电融合方法

原生质体电融合法自Senda等提出以后，经Zimmermann等的改进与发展，已经成为植物体细胞杂交的一个重要手段。原生质体融合为有性不亲和种属间的核基因及胞质基因的转移与重组提供了机会，对作物新品种的培育具有重要意义。小麦细胞融合的研究开展较晚，但随着小麦原生质体培养及植株再生技术的突破，已使细胞融合研究提上了日程。

到1990年，刘大钧团队按既定目标，在小麦、黑麦草原生质体培养的基础上，对如何提高原生质体分裂和植株再生频率、原生质体融合的方法与条件以及结合细胞融合仪的研制进行了系统的研究，完成了小麦原生质体再生植株，同时他们还成功研制出南农CY-1型细胞电融合仪。南农CY-1型细胞电融合仪是刘大钧组织了从事原生质体培养和融合研究的吴琴生以及从南京大学物理系毕业来南农工作、很有理论基础的姚国顺、周静娴夫妇一起研究成功的。经过一系列的实验表明，南农CY-1型细胞融合仪的性能已经达到各类生物细胞融合所要求的指标，可广泛应用于植物、微生物、动物等细胞融合的研究，而且该仪器有较高的性价比，可作为细胞融合的有效工具。南农CY-1型细胞融合仪后来通过江苏省科委的技术成果鉴定，达到国内先进水平，不仅为自己实验室，还为国内相关单位实验室开展类似研究创造了条件（注：DA-020-002，《小麦原生质体培养、高效成株及细胞融合技术的最终研究报告》。存于南京农业大学档案馆。）。

在电融合技术支持下，刘大钧团队在1990年首次报道了普通小麦与多年生黑麦草间原生质体的电融合，采用碘乙酰胺处理小麦原生质体，并通过同工酶和限制性片段长度多态性分析（RFLP），证明获得小麦与黑麦草体细胞杂种再生愈伤组织（注：DA-020-002，《小麦原生质体培养、高效成株及细胞融合技术的最终研究报告》。存于南京农业大学档案馆。）。通过此次实验还表明小麦与其亲缘种属间可以通过细胞融合转移种质，扩大有益基因的利用范围；小麦和多年生黑麦草原生质体经电融合处理后，原生质体能正常分裂和再生愈伤组织，在适宜的电场强度范围内，用电融合法进行体细胞杂交是有效的。刘大钧团队将实验室所获得的6个杂种细胞系用ADH同工酶作重复鉴定，在用其他同工酶和RFLP鉴定时，各个细胞系不同程度地显示了具有全部双亲谱带（HP6-50）或黑麦草与部分小麦谱带结合的杂种类型（HP6-16、24、28、47、64）。分析其原因可能是小麦悬浮细胞系的染色体数目和结构在离体培养过程中已发生较大变化。细胞学研究表明，该小麦细胞系染色体变异范围在2n=29-58之间，以2n=31为主，偏离正常染色体数（2n=42）。

1991年，刘大钧、吴琴生团队发表了《普通小麦和黑麦草原生质体电融合的适宜条件》论文，该文指出：在同一电场条件下，不同物种原生质体的电融合反应有差异，渗透压较低的融合液有利于原生质体融合；在适宜的电脉冲处理后，原生质体存活率与对照相似，经融合处理的原生质体培养一个月，其植板率有所提高。在电融合技术支持下，刘大钧团队还对苇状羊茅、大麦以及“中国春”小麦的原生质体培养进行了研究，为其后进一步开展小麦染色体工程研究积累了经验。